Application Note SoftMax Pro GxP版およびStandard版
における平行線解析と相対活性の評価

はじめに

GMP（適正製造規範）およびGLP（適正試験所規範）に準拠したラボでは、生物学的アッセイの解析に平行線解析（PLA：Parallel Line Analysis）が頻繁に用いられます。PLAは、製品そのものの直接的な測定ではなく、何らかの生物学的効果を測定する場合に、用量反応曲線を比較するための一般的な手法です（図1）。平行線解析では、2つの物質に対する生物学的応答が類似しているか、あるいは異なる生物学的環境が同一物質に対して類似した用量反応曲線を示すかどうかを評価できます。平行性の検定は、化合物の**相対効力（Relative Potency）**を算出するための前提条件であり、医薬品開発において重要な役割を果たします。具体的には、薬剤の比較、分析対象の確認、交差反応性の評価、干渉物質の影響、マトリックス補正、濃度推定、阻害試験など、さまざまな応用に活用されます。

2つのカーブが平行であると定義されるのは、一方の関数が他方の関数に対して、x軸方向に右または左へスケーリングされた形で得られる場合です。すなわち、\( ƒ(x) = ƒ(rx) \)で表され、ここで x は用量、r はスケーリング係数、すなわち相対効力を意味します *1。通常、**基準カーブ（既知の薬剤）**に対して相対効力は1と設定され、基準カーブを試験カーブ（未知の薬剤）に変換するために使用されるスケーリング係数が、未知薬剤の相対効力となります。この手法は、濃度範囲全体で傾きが一定である線形回帰カーブフィットにおいて有効に機能します（図2）。しかし、非線形回帰カーブフィット（たとえば4パラメータや5パラメータのロジスティック曲線）の場合、シグモイド型の用量反応曲線は濃度範囲全体で傾きが変化するため（図1）、より複雑な解析が必要となります。

平行性を検定する手法は、平行性の仮説をどのように評価するかに基づいて、応答比較テストとパラメーター比較テストの2つに分類されます *1。本アプリケーションノートでは、これら両方の手法について解説し、SoftMax® Pro GxP版およびStandard版において平行性を検定する方法を紹介しています。プロトコールには、F検定¹²によるF値の確率評価、およびカイ二乗検定³によるカイ二乗確率評価が実装されています。さらに、**フィエラーの定理（Fieller’s theorem）**を用いたパラメーター比較法も開発されており、「Parallelism Test」としてSoftMax Proのプロトコールライブラリ内の「Data Analysis」サブフォルダーに収録されています。これらの手法は、線形回帰カーブだけでなく、非線形回帰カーブにも適用可能であり、バイオアッセイにおける相対効力の評価や、薬剤の比較、交差反応性の検証、干渉物質の影響評価など、さまざまな薬理学的解析に活用できます。

平行性の検定

応答比較テスト（Response Comparison Test）

生物学的システムは、理想的な挙動を示さないことが多く、データにはノイズやばらつきが加わる傾向があります。そのため、平行性解析を行う前に、適切なカーブフィットモデルを選択し、必要に応じて重み付け係数を適用してこれらの変動に対応することが、最初の重要なステップとなります。不適切なカーブフィットモデルを選択すると、平行性の評価指標にバイアスが生じ、誤った結論につながる可能性があります。

特に非線形回帰では、アッセイデータにおいて完全に平行なカーブフィットが得られることは稀であるため、非平行なカーブの相対効力を算出するのは困難です。応答比較法では、検定対象のカーブを制約付きモデル（カーブを強制的に平行にする）と独立モデル（カーブを個別にフィットする）にそれぞれ適合させ、統計指標を用いて両モデル間の適合度の差を比較します。この差異は、非平行性に起因する可能性があります。

制約付きモデルにフィットさせた場合、カーブを記述するパラメーターは、X値を表すパラメーターを除いてすべてのカーブで共通となります。線形カーブの場合、X値は切片に相当し、非線形カーブの場合は、上限と下限のアシンポート（漸近値）の中間点、すなわちEC₅₀に相当します。SoftMax Pro ソフトウェアには、線形フィットの相対効力を算出するツールに加え、非線形カーブに対しても、制約付き（グローバル）フィットモデルおよび独立モデルの両方を用いて相対効力を評価する機能が搭載されています。

帰無仮説の検定

応答比較法では、算出される平行性の評価指標は、**残差平方和（RSSE）に基づくことが多く、制約付きモデルがデータにどれだけ適合しているかを判断するために用いられます。特に、余剰平方和解析（Extra-Sum-of-Squares Analysis）*1*2を用いた手法が開発されており、これは分散分析（ANOVA）**の一種で、帰無仮説として「制約付きモデルが正しい（すなわちカーブが平行である）」と仮定します。この帰無仮説は、F検定¹²による確率やカイ二乗検定 *3による確率など、さまざまな統計手法を用いて検定することができます。いずれの方法でも、確率は0から1の間の数値として報告され、確率が1に近づくほど、カーブが平行である可能性が高いと判断されます。ただし、F検定には注意すべき点があります。独立モデルが非常に適合している場合に偽陽性が生じる可能性があり、逆に適合度の低い独立モデルでは偽陰性が生じる可能性もあります。これら2つの統計手法は、SoftMax Pro ソフトウェアにも実装されており、以下の数式を用いて簡単に検定値と確率を取得できます：

• ChiSquaredPLA(PlotName@GraphName)：簡略化されたカーブフィットに対するカイ二乗統計量を返します
• ChiProbabilityPLA(PlotName@GraphSection)：簡略化されたカーブフィットに対するカイ二乗確率分布値を返します
• FStatPLA(PlotName@GraphSection)：簡略化されたカーブフィットに対するF検定統計量を返します
• FProbPLA(PlotName@GraphSection)：簡略化されたカーブフィットに対するF検定確率を返します

注意：上記の数式はすべて、Curve Fit Settings ダイアログで「Global Fit (PLA)」オプションが有効になっている場合のみ使用可能です。PlotName@GraphName はグラフ名を含むプロットの完全な名称で、例として Plot#1@Graph#1 や Std@Standardcurve などが挙げられます。特定のプロット名の指定は任意ですが、カイ二乗値は指定されたグラフ内のすべてのプロットから算出されます。

「Parallel Line Analysis Using F-test and Chi-squared Test」というプロトコールが開発されており、これら2つの統計検定法に基づいて平行性を評価することができます。データを取得またはインポートすると、計算が自動的に実行され、カーブが平行とみなせるかどうか（すなわち帰無仮説が正しいか）を判定します。

このプロトコールでは、F検定およびカイ二乗検定の確率が0.05以上である場合に、カーブは平行であると判断されます。この設定では、概ね95%の信頼度で帰無仮説が正しいとみなされます。なお、この信頼水準は、実施するアッセイにおける許容可能な非平行性のレベルに応じて調整することが可能です

ノイズと重み付け

ノイズとは、測定された応答のランダムなばらつきを指します。これは平行性を評価する際に重要な要素であり、非平行性を検出する能力に影響を与えます。ノイズレベルが高い場合、平行性の評価指標は非平行性を検出できなくなり、ノイズの影響が支配的になります。

F検定とカイ二乗検定は、それぞれ異なる方法でノイズレベルを考慮して確率を算出します。F検定の確率はノイズの影響を受けませんが、カイ二乗検定の確率はノイズレベルに大きく依存し、データの分散が正確に推定されている必要があります。そのため、カイ二乗法を使用する場合には、**逆分散重み付け（inverse variance weighting）**が必要となります。

アプリケーションノート「SoftMax Pro GxP版およびStandard版における最適な重み付け係数の選択」でも述べられているように、バイオアッセイではカーブの上部で分散が大きくなる傾向があります。重み付けなしの回帰では、平行性の結果がカーブ上部のデータ点に支配され、応答カーブの下部からの情報がほとんど反映されなくなる可能性があります。

ソフトウェアプロトコールでは、使用される重み付け係数は分散の逆数ですが、必要に応じてより適切な重み付け係数に調整することも可能です。さらに、「**Weights are Inverse Variances（重みを分散の逆数として扱う）」**オプションを指定することもできます（図4G）。カイ二乗プロファイル法によるパラメーターの信頼区間の算出（図4H）は、このオプションが有効になっている場合にのみ使用可能です。最適な重み付け係数を設定することで、結果がばらつきの大きいデータ点に左右されることを防ぐことができます。

SoftMax Pro GxP ソフトウェアにおける平行線解析（PLA）の適用方法

SoftMax Pro ソフトウェアでは、ポイント・トゥ・ポイント、ログ・ロジット、三次スプラインを除くすべてのグローバルカーブフィットに対してPLAを適用することが可能です。グラフセクション内では、すべてのプロットに同一のカーブフィット関数が適用されます。PLAの実装方法は図4に示されています。

パラメータ比較法

応答比較法が用量反応カーブの違いを直接評価するのに対し、パラメーター比較法では、制約のないカーブの各パラメーターを、指定された信頼区間内に収まるかどうかで個別に比較します。パラメーターの組が、指定された信頼水準に基づく信頼区間内に収まる必要があります。この評価方法は**同等性検定（Equivalence Testing）**と呼ばれ、指定された閾値未満の平行性を検定します。**欧州薬局方（European Pharmacopoeia）で使用されているスロープ比法（Slope Ratio Method）**は、この同等性検定の一例です。

Fiellerの定理

Fiellerの定理は、2つのパラメーターの比率に対する信頼区間を統計的に算出するための手法です *4。tInv関数を用いて比率を推定し、自由度に基づくStudentのt分布に従って確率 ppp を計算します。SoftMax Pro ソフトウェアには、基準カーブと試験カーブなど、2つのカーブ間のカーブフィットパラメーターの比率に対する信頼区間を算出する統計式が含まれています。これらの計算を組み込んだプロトコール（図5）が開発されており、確率は0.1（90%信頼区間）に設定されていますが、必要に応じて調整可能です。基準カーブと試験カーブが平行とみなせるかどうかを判断するには、算出された信頼区間が、指定された信頼水準に基づく固定された信頼区間と比較されます。このプロトコールでは90%の信頼水準が適用されており、したがって、算出された信頼区間が0.9〜1.1の範囲内であれば、カーブは平行と判断されます。

線形回帰カーブの場合、この検定は基準カーブと試験カーブのスロープ値（SoftMax ProではパラメーターB）に適用されます。一方、非線形回帰カーブでは、上限アシンポートおよびスロープに対して検定が行われます。下限アシンポートは、フィエラーの定理の数学的制約により検定対象外です。低濃度領域ではパラメーターの分散が大きくなり、虚数を含む中間計算が発生するため、信頼区間の算出が不正確になるか、計算不能となる可能性があります。この問題に対して、米国農務省（USDA）獣医生物製剤センターは、下限アシンポートをゼロに固定し、スロープと上限アシンポートを検定に使用することを推奨しています⁵。同様に、SoftMax Pro ソフトウェアに含まれる「Parallelism Test」プロトコールでは、下限アシンポートを自動的にゼロに設定し、**スロープ（パラメーターB）とパラメーターAまたはD（上限アシンポート）**を用いて、基準カーブと試験カーブが平行かどうかを判定します（図5）。

結論

多くの生物学的アッセイでは、用量反応カーブのペア間での平行性の評価が求められます。本アプリケーションノートでは、F検定やカイ二乗検定などの応答比較法と、フィエラーの定理を用いたパラメーター比較法について解説しています。SoftMax Pro ソフトウェアでは、制約付きモデルと非制約モデルのいずれかを選択でき、解析のための高度な統計式が提供されています。また、各検定に対応したセクションを含む事前作成済みのプロトコールも搭載されており、2つのカーブを記述するパラメーターの一部またはすべてについて、適切な方法を選択して平行性を簡便に評価することが可能です。

さらに、SoftMax Pro GxP版のデータインテグリティ機能と組み合わせることで、FDA 21 CFR Part 11およびEudraLex Annex 11に準拠したラボ環境において、平行性の評価および相対効力の算出を実施することができます。

参考文献

1. , P.D. and Dunn, J.R. 2005. Measuring parallelism, linearity, and relative potency in bioassay and immunoassay data. Journal of Biopharmaceutical Statistics 15(3): 437-463.
2. Bates D. M. and Watts D. G. 1988. NonLinear Regression Analysis and its Applications. New York, Wiley.
3. Draper, N. R. and Smith H. 1998. Applied Regression Analysis. 3rd Ed. New York, Wiley.
4. Buonaccorsi, J. P. 2005. Fieller’s Theorem. In: Armitage, P., Colton, T., editors. Encyclopedia of Biostatistics. 2. Vol. 3. New York, Wiley.
5. United States Department of Agriculture Center for Veterinary Biologics Standard Operating Policy/Procedure. 2015. Using Software to Estimate Relative Potency. USDA Publication No. CVBSOP0102.03. Ames, IA.