Application Note GenePix 4000BのPMT調整

はじめに

Chang Wang, Ph.D. and Sean Carriedo, Ph.D. Axon Instruments, Inc. 3280 ウィップル・ロード、ユニオン・シティ、CA 94587

最終更新日：2001年8月15日

GenePix 4000Bは、Cy3やCy5のような蛍光色素を励起するために2つのレーザーを使用し、放出された蛍光を検出するために1対の高感度、低ノイズの光電子増倍管（PMT）を使用しています。光電子増倍管は、光電効果によって入射光子を電子に変換する光学部品です。入射光子がPMTの活性表面（光電面）に衝突すると、光電子が発生します（図1）*1, *2, *3。この電子は、一連の電子増倍管（ダイノード）を通ってアノードへと流れます。アノードから流れる電流量は、光電面への入射光量に正比例します。

PMTの利得はダイノードに印加される電圧に依存します。印加された電圧は電子をダイノードへと加速します。PMT 電圧が高いほど、電子が陽極に衝突するエネルギーが大きくなり、解放される電子の数が増えます *1 。GenePix Pro ソフトウェアの PMT ゲイン（電圧）設定を上げると、PMT の感度が上がります。

最適な PMT ゲインを使用することが重要です。ゲインが高いほど画像が明るくなるのは事実ですが、画像が明るければ良いというわけではありません。PMTのゲインを上げると、信号強度だけでなくノイズも増加します。ゲインが高すぎると、信号よりもノイズの方が大きくなり、シグナル対ノイズ比が悪くなります *1。PMTゲインを低く設定しすぎると、光子を電子に変換するプロセスが最適でなくなり、シグナル対ノイズ比が低くなります。GenePix 4000B（）では、PMT ゲインを 500 ～ 900 に設定すると、最良のシグナル対ノイズ比が得られます。一般的に、PMTゲインを400以下にすることは推奨しません。色素からの蛍光強度がフルレーザー出力で飽和する場合は、極端に低い PMT 電圧を使用するのではなく、レーザー出力を下げる必要があります。

PMTを最適に設定するためには、3つの目標を満たす必要がある：

1. GenePixスキャナーのダイナミックレンジをすべて使用します。GenePixはPMT出力を16ビット、すなわち65,536の強度レベルにデジタル化します。PMT ゲインを高く設定しすぎると、信号は飽和します。PMT ゲインを低く設定しすぎると、信号がダイナミックレンジ全体をカバーしなくなり、実質的に解像度が低下します。
2. シグナル対ノイズ比が最も高くなるPMTゲイン設定を選択します。可能であれば、PMTゲインを500～900の間で使用するようにしてください。
3. 両チャンネルの蛍光強度が同程度になるようにします。

PMT ゲインの調整手順：

1. マイクロアレイスライドをスライドホルダーにセットします。
2. ハードウェア設定ボタンをクリックして、ハードウェア設定ダイアログボックスを開きます。レーザーパワーとPMT電圧を変更するオプションがあります。初期設定として、両チャンネルのPMT電圧を600、Power (%)を100に設定します。
3. Preview Scan ボタンをクリックし、プレスキャンを行います。このスキャンモードは解像度が低いため高速で、光退色も少ないです。
4. フィーチャーが表示され始めたら、ハードウェア設定ダイアログボックスの上下矢印を使用して、両チャンネルの PMT ゲインを調整します。PMT ゲインを上げると、画像の強度が上がります。以下の例は Cy3 と Cy5 に特異的な仕様ですが、ロジックは他のレーザー構成にも当てはまります。スライドにコントロールスポットがある場合は、コントロールスポットの色がはっきりと黄色になるようにPMT電圧を調整します。スライドにコントロールスポットがない場合は、スポットの大部分が黄色、一部が赤、一部が緑になるようにPMT電圧を調整します。このような調整は、多数のサンプルを調査する場合、一部のサンプルはアップレギュレーションになり、一部のサンプルはダウンレギュレーションになるという仮定に基づいています。すべてのフィーチャーが緑の場合は、赤チャンネルのPMT電圧を上げます。すべてのフィーチャーが赤の場合、緑チャンネルのPMT電圧を上げます。PMT電圧がバランスしている場合、ほとんどのスポットの色は黄色になるはずです（図2）。フィーチャーが飽和（白）している場合は、PMT電圧を下げます。
5. 画面上部の "Histogram "タブをクリックすると、強度ヒストグラムが表示されます。ヒストグラムには、赤と緑の両チャンネルのすべての強度の正規化されたピクセル数が表示されます。高輝度のエンドツーエンドでは、2つのトレースがよりはっきりと見えるため、対数軸を使用することをお勧めします。
6. 
7. ヒストグラムは、PMTゲインが最適であるときを示します。PMTが正しく調整されると、ダイナミックレンジがフルに活用されます。65,500の強度範囲には、両チャンネルで数ピクセルが見られます。両チャンネルの強度がバランスすると、赤と緑のトレースが重なります。ヒストグラムでは、曲線の低輝度部分がSB比であり、高輝度部分がプリントスポットからのシグナルです。緑色と赤色の両方の曲線が高輝度領域で多かれ少なかれ重なっている場合、緑色チャンネルと赤色チャンネルの特徴の蛍光強度は類似します。高輝度領域でカウント数が多くなるのを防ぐため、PMTゲインを400以下に下げなければならない場合は、レーザー出力を下げてPMTゲインを高くする必要があります。
8. Imageタブをクリックしてスキャン画像を見る。PMTがうまく調整されている場合、スポットははっきりと見えるはずであり、スポットの大部分がコントロールスポットであれば、スポットの大部分は黄色であるはずです。
9. プレビュースキャンを停止し、データスキャンを開始します。

考察

両チャンネルの蛍光強度が同程度になるようにPMTのバランスをとることを推奨していますが、2つのチャンネルのバランスが完全にとれていなくても大きな誤差は生じないです。現実には、両チャンネルのシグナル強度が同じであることはありえないです。このわずかな不均衡は、正規化係数を用いてソフトウェアで補正されます。GenePix Pro ソフトウェアは、与えられたマイクロアレイ上のすべてのフィーチャーからの比の算術平均が 1 4 に等しくなるべきであるという前提に基づいて、正規化因子を計算します。2つのチャンネルが完全にバランスしている場合、正規化係数は1です。

正規化係数が1に近くなるようにPMTを調整することを提案するのは、主に2つの理由からです：

1. ダイナミックレンジを最適化するため。1つのチャンネルがフルダイナミックレンジを使用しているにもかかわらず、正規化係数が1に近くない場合、2番目のチャンネルは最良のダイナミックレンジを使用していません。
2. 画像の視覚効果を最適化します。2つのチャンネルのバランスがとれている場合、正規化係数は1に近いです。スポットの緑色または赤色は、遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを示します。

ほとんどの場合、正規化係数が1より低くても高くても解析結果は正しいです。PMT電圧が推奨範囲外であったり、蛍光シグナルを適切に検出するのに必要な電圧以下でない限り、データのインテグリティは保たれます。正しい比率を計算するためには、分析プロセスで正規化係数を使用するだけでよいです。

参考文献

1. Hamamatsu Photonics K.K. Photomultiplier Tube. Hamamatsu Photonics K.K. Publish. (1994)
2. Dempster J. Fast Photometric Measurements of Cell Function Combined with Electrophysiology. pp.199-200. In Mason, W.T. (Ed.) Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Academic Press, London. (1999)
3. Shinya Inoue and Kenneth R. Spring. Video Microscopy second edition. pp. 233-8. Plenum Press, New York. (1997)
4. Trent Basarsky, Damian Verdnik, Jack Ye Zhai and David Wellis. Overview of a Microarray Scanner: Design Essetials for an Integrated Acquisition and Analysis Platform. pp. 265-84. In M. Schena (Ed.) Microarray Biochip Technology. Eaton Publishing, MA. (2000)