Application Note 血清サンプル中のSARS-CoV-2スパイクおよび
ヌクレオカプシドIgG抗体の定性測定
- ヌクレオキャプシドおよびスパイクIgG抗体の特異性を95%以上獲得
- ハイスループット、定性イムノアッセイでキットあたり最大86検体を測定
- アッセイ間／アッセイ間精度に優れた比色分析出力
PDF版（英語）
はじめに
Cathy Olsen, PhD | Sr. Applications Scientist | モレキュラーデバイス
Heather Mary Brown, PhD | Application Scientist | Enzo Life Sciences
SARS-CoV-2（COVID-19）の大流行を乗り切るためには、迅速、正確、かつ頻繁な分子検査が極めて重要です。感染と免疫の関係についての理解を深めるためには、感染だけでなく抗体も検査することが重要です。基本的な課題は、これらの要件を満たし、感度が高く、一貫性があり、利用しやすい検査法を、手頃な価格で特定し、実施することです。ウイルスmRNAを検出する定量的RT-PCR検査は、現在市販されている検査の中で、既存の感染を特定するための最も正確な検査です。しかし、これは免疫反応を明らかにするものではないです。病気を特定する検査法の開発に大きな重点が置かれていることを考えると、抗体検査のためのアッセイ開発の進歩は不十分なままです。現在市販されている抗体検査では偽陽性が多く、SARS-CoV-21に対する免疫反応のニュアンスを理解するための信頼できる方法ではないです。したがって、COVID-19免疫と抗体反応を調査するための信頼性の高いハイスループットな方法は、対応されていないニーズです。
Enzoは、ヒト血清および血漿サンプル中のSARS-CoV-2ヌクレオキャプシドタンパク質に対するIgG抗体を検出するために特異的に最適化された最先端の酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を開発しました（ENZ-KIT193）。SARS-CoV-2 ヌクレオキャプシド IgG タンパク質は、SARS-CoV-2 ウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質に対するヒトの適応免疫反応の一部として生成される抗体です。ヌクレオカプシドタンパク質は、RNAのパッケージングとウイルス粒子の放出に重要です。ヌクレオキャプシドタンパク質に対する抗体の存在は、最近または以前に感染したことを示します。ヌクレオカプシドタンパク質は高度に保存されており、経時的変異の影響を受けにくいため、COVID-19免疫の長期的研究に最適なターゲットです *2。
さらにEnzoは、ヒト血清中のSARS-CoV-2 Spikeタンパク質に対する特異抗体を検出できるELISAキット、SARS-CoV-2 Spike IgG ELISA Kit (RUO)（ENZ-KIT190）を開発しました。SARS-CoV-2 Spike IgG タンパク質は、SARS-CoV-2 ウイルスの Spike タンパク質に対するヒトの適応免疫反応によって生成されるもう一つの抗体です。Spikeタンパク質は、ヒト細胞表面のACE2レセプターとウイルスが結合し、細胞内に侵入して複製を行うのに必須です。したがって、現在利用可能ないくつかのワクチンの標的となっています。
EnzoのSARS-CoV-2 Nucleocapsid IgG ELISA KitおよびSARS-CoV-2 Spike IgG ELISA Kitは、COVID-19感染に対する抗体反応と免疫、およびワクチン研究を決定する、現在および将来の研究のための主要なツールです。
どちらのELISAキットも、それぞれ30分または2時間以内に最大86検体の標的分析物であるヌクレオカプシドIgG抗体およびスパイクIgG抗体に対して、広い検出範囲、高感度、95%以上の特異性を示します。このように、これらのキットは精度とスピードの要件を上回っており、研究を前進させる多くの応用の可能性を提供しています。ウイルス曝露後の抗体の挙動をより深く理解することで、研究者は感染後のSARS-CoV-2免疫反応の特徴を明らかにすることができ、またこの感染性の高いウイルスに対する免疫に関する基本的な疑問を理解するためのツールとなります。
材料
- SARS-CoV-2 スパイク IgG ELISA キット (RUO) (Enzo)
- SARS-CoV-2 ヌクレオカプシド IgG ELISA キット（RUO）（Enzo）
- ヒト血清 COVID-19 陽性（BioIVT）
⚪︎ロット番号 HMN368394-SR1
⚪︎ロット番号 HMN368436-SR1
⚪︎ロット番号 HMN368437-SR1
⚪︎ロット番号 HMN373782-SR1
⚪︎ロット番号 HMN373791-SR1
⚪︎ロット番号 HMN374206-SR1 - ヒト血清オフザクロット（陰性）（Amsbio）：
⚪︎ロット#122019A - SpectraMax® ABS Plusマイクロプレートリーダー
測定方法
アッセイセットアップ
各キットのアッセイコントロー ルと重複血清検体を測定するのに十分なウェルストリップを含め、2種類のキットの各材料を使用前に室温に戻しました。20X Wash Buffer 濃縮液を水で希釈し、1X Wash Buffer を調製しました。
SARS-CoV-2 陽性患者からの血清検体、またはパンデミック前に採取した正常血清検体は、各キットの製品マニュアルに記載されている通り、検体希釈液で希釈して調製しました。
各ELISAキットの実施手順を表1に示します。
図1. SARS-CoV-2 IgG ELISA（間接ELISA法）。SARS-CoV-2 IgG ELISAの概略図。ウェルの底には、SARS-CoV-2 ヌクレオカプシドタンパク質またはスパイク S1 受容体結合ドメイン（抗原）がコーティングされています。血清サンプル中に抗原が存在する場合、抗原に特異的なIgGがコートされたウェルに結合し、HRP標識抗体により、基質を添加することで結合したIgGを検出することができます。
| SARS-CoV-2ヌクレオカプシドIgG ELISAキット | SARS-CoV-2スパイクIgG ELISAキット |
|---|---|
| 血清サンプルをサンプル希釈液で1:200に希釈 | 血清検体をサンプル希釈液で1:10に希釈 |
| ウェルにキャリブレーション液と検体を添加 | High、Low、Negativeコントロールと検体をウェルに添加 |
| 室温（RT）で10分間インキュベート | 37℃で30分間インキュベート |
| 洗浄液で3回洗浄 | 洗浄液で4回洗浄 |
| ウェルにヌクレオキャプシドコンジュゲートを添加 | ウェルにHRPコンジュゲートを添加 |
| 10分間インキュベート | 37℃で15分間インキュベート |
| 洗浄液で3回洗浄 | 洗浄液で5回洗浄 |
| すべてのウェルにTMB基質を添加 | すべてのウェルにTMB基質を添加 |
| 室温で10分間インキュベート | 37℃、暗所で15分間インキュベート |
| 停止液を添加 | 停止液を添加 |
| Read plate at 450 nm | Read plate at 450 nm |
表1. 各SARS-CoV-2 ELISAキットの実施手順。
SARS-CoV-2 ヌクレオカプシド IgG ELISA の結果の計算
キャリブレーションおよび血清検体を含むすべてのウェルの OD 値からブランクウェルの平均 OD 値を差し引くことにより、正味 OD 値を算出しました。
正味検体 OD = 検体 OD - ブランク平均 OD
各キャリブレーターの平均OD値を、SoftMax® Proソフトウェアの4-parameter logistic curve fitを用いて濃度に対してプロットしました（図2）。
図2. SARS-CoV-2 ヌクレオカプシド IgG ELISA キットのcalibrator curve。この曲線は、SoftMax® Proソフトウェアで4-parameter logistic curve fitを用いてplotされました。この曲線から、結果が半定量的に算出されました。
次に、calibrator curveから内挿法で結果を半定量的に算出しました。補間濃度≦2000ng/mLはSARS-CoV-2 IgGの非存在を意味し、補間濃度＞2000ng/mLはSARS-CoV-2 IgGの存在を意味しました。
SARS-CoV-2スパイクIgG ELISAの結果の計算
陰性コントロール、低陽性コントロール、高陽性コントロール、血清サンプルを含むすべてのウェルのOD値からブランクウェルの平均OD値を差し引くことにより、正味OD値を算出しました：
正味検体OD = 検体OD - ブランク平均OD
各検体について、以下の式を用いてインデックス値を算出しました：
カットオフ値0.08は製品マニュアルに記載されており、結果の算出に使用されました。インデックス値が1以上であれば陽性、1未満であれば陰性です。すべての計算はSoftMax® ProソフトウェアのGroup tableで設定され、ELISAプレートの読み取り時に結果の自動計算を可能にしました。
結果
どちらのELISAキットでも、COVID-19陽性患者の血清検体は陽性と判定されました。これは、これらの検体がすべてヌクレオカプシドIgGとスパイクIgGの両方を封じ込めたことを意味します。正常血清サンプルは両アッセイで陰性でした。データから自動的に算出された結果を示すSoftMax Proソフトウェアのグループ表を表2（ヌクレオカプシドIgG ELISAキット）および表3（スパイクIgG ELISAキット）に示します。
| Sample | Wells | Value | AvgValue | R | Result | MeanResult | SD | %CV | Dilution | Adjresult_ng/ml | SemiQuantResult |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 01 |
C2 D2 |
0.401 0.328 |
0.365 |
12.201 9.645 |
10.923 | 1.807 | 16.5 | 200 | 2184.545 | POS | |
| 02 |
E2 F2 |
3.449 3.488 |
3.469 | R |
239.379 245.870 |
242.624 | 4.590 | 1.9 | 200 | 48524.844 | POS |
| 03 |
G2 H2 |
2.192 1.991 |
2.092 | R |
102.831 88.732 |
95.781 | 9.969 | 10.4 | 200 | 19156.222 | POS |
| 04 |
A3 B3 |
2.144 2.266 |
2.205 |
99.288 108.329 |
103.809 | 6.394 | 6.2 | 200 | 20761.716 | POS | |
| 05 |
C3 D3 |
2.160 2.149 |
2.155 |
100.476 99.704 |
103.809 | 0.546 | 0.5 | 200 | 20017.992 | POS | |
| 06 |
E3 F3 |
0.594 0.547 |
0.571 |
19.202 17.461 |
18.331 | 1.231 | 6.7 | 200 | 3666.248 | POS | |
| 07 |
E3 F3 |
0.066 0.055 |
0.061 |
0.923 0.564 |
0.743 | 0.254 | 34.2 | 200 | 3666.248 | POS |
表2. SARS-CoV-2 ヌクレオカプシド IgG ELISA キットの結果。結果はcalibrator curveから内挿法で半定量的に算出し、SoftMax® Proソフトウェアのグループ表に表示しました。Rは、OD値がcalibrator curveの範囲外であったサンプルを示します。
| Sample | Wells | NetValues | MeanNetValue | Std.Dev. | CV% | IndexValue | Result |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 01 | C2
D2 |
1.771
1.784 |
1.777 | 0.009 | 0.497 | 22.216 | POS |
| 02 | E2
F2 |
2.100
2.024 |
2.062 | 0.054 | 2.610 | 25.774 | POS |
| 03 | G2
H2 |
2.508
2.418 |
2.463 | 0.064 | 2.604 | 30.778 | POS |
| 04 | A3
B3 |
1.972
1.990 |
1.981 | 0.013 | 0.650 | 24.765 | POS |
| 05 | C3
D3 |
1.869 1.804 |
1.837 | 0.046 | 2.498 | 22.962 | POS |
| 06 | E3
F3 |
0.790
0.766 |
0.778 | 0.017 | 2.190 | 9.727 | POS |
| 07 | G3
H3 |
0.039
0.028 |
0.034 | 0.007 | 21.822 | 0.421 | NEG |
表3. SARS-CoV-2スパイクIgG ELISAキットの結果。指標値は計算され、サンプル結果はSoftMax® Proソフトウェアのgroup tableにpositiveまたはnegativeとして表示されました。
結論
これらのデータから、Enzo社のキット、SARS-CoV-2 Nucleocapsid IgG ELISA Kit (RUO) (ENZ-KIT193) および SARSCoV- 2 Spike IgG ELISA Kit (RUO) (ENZ-KIT190) は、ヒト検体中のヌクレオカプシド IgG 抗体およびスパイク IgG 抗体を検出するための正確でハイスループットかつ迅速なソリューションであることがわかりました。さらに、これらのキットはSpectraMax ABS PlusプレートリーダーとSoftMax Proソフトウェアで簡単に実行できるため、一貫性のある効率的な結果が得られます。これらの定量的および半定量的データは、個々の患者サンプルの特異性IgG分析のための貴重な指標を提供するだけでなく、集団サーベイランス研究に貢献する正確なデータをご提供します。したがって、SARS-CoV-2に対する感染と免疫反応に関する集団調査において、免疫原性反応のニュアンス、免疫の持続時間、およびパターンを理解するための将来的な調査のために、これらのソリューションを臨床に導入する新たな機会をご提供します。両キットの応用は、将来のパンデミックの予防と管理に大きな役割を果たすことができます。
参考文献
- https://www.uclahealth.org/antibody-serology-testing#howdoestestwork
- Dutta NK, Mazumdar K, Gordy JT. The Nucleocapsid Protein of SARSCoV-2: a Target for Vaccine Development. J Virol. 2020;94(13):e00647-20. Published 2020 Jun 16. doi:10.1128/JVI.00647-20
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