Application Note SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダーで
SimpleStep ELISAキットを用いて
インターロイキン-8濃度を定量する

  • トップページ
  • ＞
  • Application Note
  • ＞
  • SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダーで SimpleStep ELISAキットを用いて インターロイキン-8濃度を定量する
  • AbcamのSimpleStep ELISAキットを使用し、感度と再現性を損なうことなくELISA実験時間を260分から90分に短縮。
  • SpectraMax ABS/ABS Plusマイクロプレートリーダーを使用することで、ELISAプレート全体をわずか5秒で読み取ることができます。
  • SoftMax Proソフトウェアでサンプル濃度を自動計算し、結果をプロットします。
資料ダウンロード

PDF版（英語）

はじめに

Cathy Olsen | Sr. Applications Scientist | Molecular Devices

急性単球性白血病患者由来のヒト単球細胞株であるTHP-1は、試験管内でマクロファージの機能を研究するためにしばしば使用される。THP-1セルは通常懸濁液中で培養されるが、フォルボール12-ミリスチン酸13-アセテート（PMA）で処理するとマクロファージに分化し、接着細胞になる。また、様々なタイプの細胞から分泌され、急性炎症反応の制御に関与するインターロイキン-8（IL-8）などのサイトカインを放出し始める。

酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）は、96ウェルマイクロプレートフォーマットでIL-8のような分析物を定量するために一般的に用いられている。典型的なELISAは実施に4時間以上かかることがありますが、AbcamのSimpleStep ELISA®キットを用いれば、感度と再現性を損なうことなく、わずか90分でELISAを実施することができます。ここでは、SoftMax® Pro ソフトウェアの便利な事前設定プロトコルを使用して、Human IL-8 SimpleStep ELISA を実行し、SpectraMax® ABS Plus マイクロプレートリーダーで結果を検出する方法について説明します。

図1. SimpleStep ELISAキットと従来のELISAワークフローの比較。AbcamのSimpleStep ELISAキットは、その合理化されたプロトコールにより90分で結果が得られます。従来のELISAとは異なり、SimpleStep ELISAキットは1回のインキュベーションと1回の洗浄ステップのみで、アッセイ時間を約3分の2に短縮します。

材料

  • ヒト IL-8 SimpleStep ELISA キット（Abcam cat.）
  • THP-1ヒト末梢血単球（ATCC cat.）
  • THP-1培地
  • RPMI-1640培地 (ATCC cat. #30-2001)
  • ベンチマークウシ胎児血清 (Gemini cat. #100-106)
  • 2-メルカプトエタノール (Sigma cat. #M6250-100mL)
  • ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) (ThermoFisher cat. #15140122)
  • SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製 cat.）

方法

THP-1細胞の調製

20,000個の未分化THP-1懸濁細胞を96ウェルマイクロプレートの各ウェルに播種した。その後、THP-1細胞を培地で希釈した2.5 ng/µL PMA、またはDMSO（ネガティブコントロール）で処理した。処理後、細胞を37℃のインキュベーターに48時間置いた。その後、セル上清を回収し、ELISAを行うまで-80℃で保存した。

ELISA

ELISA当日、サンプル上清を解凍し、微量遠心機で2,000 x g、10分間スピンダウンして残渣を除去し、添付のサンプル希釈液で1:5、1:10、1:50に希釈した。ヒト IL-8 SimpleStep ELISA 試薬と標準品はキットのプロトコールブックレットに従って調製した。サンプルと標準品を付属のマイクロプレートに加え、抗体カクテルをウェルに加え、プレートを密封し、プレート振とう器で室温で 1 時間インキュベートした。その後、プレートのウェルを Wash Buffer PT で 3 回洗浄した。TMB基質を各ウェルに添加し、プレートを暗所でプレートシェーカーで15分間インキュベートした。Stop Solutionを各ウェルに添加し、SoftMax Proソフトウェアであらかじめ設定したプロトコルを用いて、SpectraMax ABS/ABS Plusマイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度（OD）を読み取った（ワークフローは図1を参照）。

結果

SoftMax Proソフトウェアの「HRPおよびTMB」プロトコルで、r2 = 1.000の直線的なIL-8標準曲線が作成された（図2）。この標準曲線から、DMSO処理した陰性対照セルとPMA処理したセルから得られたサンプルのIL-8濃度を補間した。希釈が不十分なサンプルは、標準曲線の範囲外（'R'）として、事前に設定されたプロトコルのグループテーブルにフラグが立てられた（図3）。PMA処理細胞のIL-8濃度は3400 pg/mLと計算され、DMSO処理陰性コントロールの63 pg/mLの55倍であった（図4）。

図2. ELISA標準曲線。IL-8 標準物質をサンプル希釈液で希釈し、ヒト IL-8 SimpleStep ELISA キットを用いて測定した。SoftMax® Proソフトウェアで標準品に線形カーブフィット処理を行い、作成された標準曲線は優れた直線性を示しました（r2 = 1.000）。

図3. 算出された検体濃度を表示した群表。PMA処理細胞のIL-8濃度は、あらかじめ設定されたSoftMax Proプロトコルによって標準曲線から自動的に補間され、グループ表に表示された。R'カラムに'R'が表示されているサンプルは、標準曲線の範囲外の濃度が計算されており、この場合はサンプルをさらに希釈する必要があることを示している。

図4. 未分化（DMSOコントロール）および分化（2.5 ng/µL PMA）したTHP-1セルで測定したIL-8濃度。2.5 ng/µL PMA処理THP-1細胞は、未分化THP-1細胞が産生した62 pg/mLのIL-8に対し、3400 pg/mLのIL-8を産生し、55倍増加した。

見出し結論

SpectraMax ABS/ABS Plusマイクロプレートリーダーは、AbcamのHuman IL-8 SimpleStep ELISAキットでIL-8を迅速かつ高感度に検出します。SimpleStep ELISAの特許取得済み抗体結合技術は、感度と再現性を損なうことなく、THP-1細胞上清中のIL-8をわずか90分、従来のELISAに必要な時間の約3分の1で定量することを可能にした。

リーダーの8チャンネル検出器は、96ウェルELISAプレート全体をわずか5秒で読み取ることができる。SoftMax Proソフトウェアにあらかじめ設定されたプロトコールにより、標準曲線が自動的にプロットされ、サンプル濃度が計算され、陰性対照と処理細胞の結果をプロットすることができるため、出版物レベルの結果を得るために必要な時間がさらに短縮されます。

SimpleStep ELISA® はAbcam plcの登録商標です。

資料ダウンロード

PDF版（英語）