Application Note 非抗体タンパク質を分泌する
哺乳類細胞の高産生株選抜
- 最適な高産生細胞の選抜確率を向上
- リミティング・ダイリューションを回避し、細胞株／抗体開発期間を短縮
- in situでの発現レベルに基づき、性能の低い細胞を早期に除外
- ロボティクスの設計改良により、コロニーへの影響を最小限に抑えつつ、正確かつ確実にコロニーを選抜
PDF版（英語）
はじめに
ClonePix® システムの技術により、治療用タンパク質を高レベルで産生・分泌する細胞コロニーを選抜することが可能です。モノマー型治療タンパク質を分泌するトランスフェクション済みCHO細胞やHEK293細胞のコロニーを、目的タンパク質に特異的な蛍光標識抗体、蛍光イメージング、ロボティクスによる処理・選抜技術を用いて選抜することで、効率が大幅に向上し、ワークフローが合理化されます。これにより、目的タンパク質を高レベルで分泌する最適な細胞株の取得が可能になります。
ClonePix システムは、半固体培地上で浮遊または接着して増殖した細胞コロニーを、目的タンパク質に特異的な蛍光（タンパク質自体に結合した抗体、または発現タンパク質の末端に付加されたペプチドタグに対する抗体）を用いてイメージングします。取得された画像は解析され、目的タンパク質の高産生クローンが選抜されます。ClonePix システムは、5つの蛍光チャネルと白色光を搭載しており、最大3つの蛍光チャネルを同時に使用することで、1回の選抜で複数のプローブを用いることが可能です。
ClonePix システムを使用することで、逐次希釈法やセルソーティング技術が不要となり、高分泌性のモノクローナル細胞集団を短期間で確立できます。これにより、細胞株の最適化やタンパク質生産のスケールアップに伴うボトルネックを解消できます。
タグなしタンパク質を産生する細胞の検出と選抜
ClonePix システムは、内在性または安定トランスフェクションされたタンパク質、あるいは目的の組換えタンパク質を分泌するクローン細胞コロニーをイメージングし、選抜します。タグのない完全長ペプチドの場合、分泌の検出にはそのタンパク質に対する蛍光標識抗体が必要です（図1）。ClonePix 技術の特性上、単一のモノクローナル抗体ではなく、複数のエピトープに対するポリクローナル抗体、または複数のモノクローナル抗体を使用することが推奨されます。
ClonePix システムは複数波長でのイメージングが可能なため、1回の選抜プロセスで複数の蛍光色素を同時に使用できます。その結果、1つのコロニーから複数のタンパク質の分泌を評価したり、タンパク質産生と細胞生存率の染色を組み合わせることも可能です。細胞コロニーは自動的に解析され、最高産生クローンが自動で96ウェルプレートにピックされます。
図1. HEK 293細胞の高分泌コロニー。目的のタグなしモノマー型タンパク質を安定的にトランスフェクションしたHEK 293細胞の高分泌コロニー（青い円）を検出。CloneMatrixベースの半固体培地で培養されたこれらのコロニーは、目的タンパク質に対するFITC標識ポリクローナル抗体を用いてイメージングされました。画像では、産生細胞／コロニーが緑色で表示され、最も高産生なコロニーの周囲には分泌されたタンパク質の雲状のシグナルが確認できます。
タグ付き組換えタンパク質を産生する細胞の検出と選抜
目的タンパク質に対する特異的抗体が利用できない場合など、直接検出が困難な場合には、タグ付き組換えタンパク質を蛍光標識抗タグ抗体で間接的に検出することが可能です。例えば、図2に示すように、目的タンパク質のC末端にHis₆-タグおよびFLAGタグ配列を付加したコンストラクトをCHO、HEK、NS0などの細胞株にトランスフェクションし、抗His抗体および抗FLAG抗体の混合物（少なくとも一方は蛍光標識済み）を用いて検出します。タグが十分に大きい場合（例：2×FLAGやヒトFcタグなど）は、単一の検出プローブでも十分な検出が可能です。
図2. タグ付き組換えタンパク質の検出原理。ClonePix システムにおけるタグ付き組換えタンパク質の検出原理。分泌されたタグ付きタンパク質はコロニー周辺に保持され、蛍光標識された抗タグ抗体を用いて可視化されます。
図3. 接着性CHOコロニーの白色光および蛍光画像。(A) 白色光画像、(B) 蛍光画像。CHO細胞は、His₆およびFLAGエピトープをC末端に含むモノマー型タンパク質コンストラクトで安定トランスフェクションされ、CloneMatrixベースの半固体培地で浮遊培養されました。His₆およびFLAGに対する抗体でイメージングされ、抗His₆抗体はFITCで標識され、分泌タンパク質の蛍光可視化が可能となりました。
この技術により、タグなしタンパク質（上記参照）やIgG分泌実験と同様の方法でタンパク質分泌を解析でき、選抜後に高分泌性のモノクローナル集団として培養・確立することが可能です。
方法
目的のタンパク質（必要に応じて2種類のエピトープタグを付加）をコードするコンストラクトで細胞株をトランスフェクションした後、標準的な方法で選択培養を行い、CloneMatrix（K8500）と2倍濃縮培地を用いて半固体培地に播種します。播種密度は、CHO細胞で\( \frac{200\,\mathrm{細胞}}{\mathrm{mL}} \)、HEK293細胞で\( \frac{1000\,\mathrm{細胞}}{\mathrm{mL}} \)が推奨されます。血清含有培地および化学定義培地のいずれも使用可能です。
目的タンパク質に対する蛍光標識ポリクローナル抗体、またはエピトープタグに対する2種類の抗体を、播種時またはイメージング・選抜の少なくとも24時間前にアトマイザーで培地に添加します。いずれの場合も、抗体の最終濃度（総量）は\( \frac{7〜10\,\mathrm{µg}}{\mathrm{mL}} \)が推奨されます。抗体の種類によっては、濃度を低くしたり、画像の蛍光強度を高めるために濃度を上げることも可能ですが、上記の濃度が最適であることが確認されています。エピトープタグを使用する場合、2種類の抗体のモル比は1:1とし、少なくとも一方は選択した蛍光色素で標識されている必要があります。
細胞は、TC処理済みプレートに播種して接着性コロニーとして培養することも、浮遊性コロニーとして培養することも可能です。イメージングの品質と選抜効率を向上させるためには、可能な限り浮遊性コロニーとして培養することが推奨されます。CHO-K1やHEK-293など、通常は接着性の細胞でも、半固体培地中で浮遊性コロニーとして培養することが可能です。
半固体培地中で約100細胞のコロニーに成長した後（通常7〜12日）、ClonePixを用いて蛍光イメージングを行います。システムソフトウェアが蛍光強度（すなわち産生量）を自動解析し、最も高分泌なコロニーを選抜して、目的の発現培地を含む96ウェルプレートに自動でピックします。選抜された細胞株は、モノクローナルな高分泌性細胞株として確立されます。
結論
ClonePix システムの技術により、逐次希釈法やセルソーティング技術が不要となり、高分泌性のモノクローナル細胞集団を短期間で確立することが可能です。これにより、細胞株の最適化やタンパク質生産のスケールアップに伴う多くのボトルネックが解消されます。作業負荷が低いため、より多くの細胞集団を並行して解析でき、細胞株スループットが向上します。ClonePix システム1台を2名の研究者で運用することで、年間100以上の細胞集団をトランスフェクションからシェイクフラスコ段階まで進めることが可能と推定されています。
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