Application Note 幹細胞由来心筋細胞を用いたハイスループット心毒性アッセイ

はじめに

心臓毒性は、臨床試験で失敗する新薬の大きな割合を占めています。心臓安全性化合物の失敗に関する非効率性と高コストを改善するためには、ハイスループット・スクリーニングに適した予測性の高いin vitroアッセイの開発が不可欠です。従来の心毒性化合物の特性評価法は、労力がかかり、時間もかかります。手動のパッチクランピングや自動電気生理学的手法は、個々のセル上の単一チャネルの解析に限られており、ハイコストでスループットが低いです。その他のハイスループットな方法では、解析のためにデータを複雑なソフトウェアにエクスポートするか、時間のかかる手動解析を行う必要があります。FLIPR® Tetraシステム上で動作するScreenWorks® Peak Pro™ ソフトウェアを使用すると、幹細胞由来の心筋細胞を用いて心毒性化合物の特性を迅速かつ容易に解析できます。幹細胞由来のヒト心筋細胞は、現在利用可能なものよりも生物学的に適切な細胞モデルを提供することにより、新規化学物質の開発を大幅に加速し、薬剤の安全性を向上させることができます。心筋細胞をScreenWorks Peak ProソフトウェアおよびFLIPR Tetraシステムと併用することで、創薬プロセスの早い段階で毒性と有効性を予測するためのロバストでハイスループットな方法を提供する統合ソリューションが得られます。特異性のある化合物を早期に失敗させたり、さらにモニタリングすることができ、前臨床試験に進める最も有望なリード化合物の優先順位をより明確にすることができます。

ハイスループットFLIPR Tetraシステム心拍アッセイ

FLIPR Tetraシステムは、GPCRおよびイオンチャネル受容体に対する早期リード化合物を同定するための柔軟で信頼性の高いリアルタイムカイネティックセルラーアッセイスクリーニングシステムです。また、FLIPR®Calcium 5アッセイキットを用いて、心筋細胞の収縮に伴う細胞内Ca2+フラックスの変化をモニターすることもできます。このアッセイでは、人工多能性幹細胞（iPSC）由来の心筋細胞（セルラー・ダイナミクス・インターナショナル社提供）にFLIPR Calcium 5アッセイキットの色素を負荷し、拍動する細胞への化合物の影響をモニターすることができます。FLIPR Tetraシステムは、96、384、または1536ウェルから読み取りながら試薬と化合物を同時に自動添加することができ、異なる時点での読み取りによるウェル間のばらつきを低減できるため、心拍動アッセイに有利です。図1 (2ページ) に示すように、心拍細胞に対する化合物の効果を解析し可視化するための時間応答曲線は、1プレートあたり約2分で取得できます。

ScreenWorks Peak Pro ソフトウェアによる自動ピーク解析

大量の化合物のアッセイを実行するには、自動データ解析が必要不可欠です。384個のトレースを手作業でカウントすると、セルビート解析は少数のパラメーターに制限され、時間がかかり、ヒューマンエラーの可能性があります。解析のためにデータを別のプログラムにエクスポートすると、情報の質や、真の自動化とハイスループットを必要とする環境での有用性を損なうステップが追加されます。ScreenWorks Peak Proソフトウェアは、FLIPR Tetraシステムですでに実行されているデータ収集および解析プログラムに統合されています。このソフトウェアの使いやすいインターフェースと直感的なセットアップにより、自動測定の精度を保ちながら、迅速で再現性の高いウェルごとの結果が得られます。

シグナルピークのパラメーターは、動的閾値と微分解析に基づいて計算され、図2に示すように、振幅、時間、周波数、レート、幅の値が得られます。

図3は、毒性の可能性がある薬剤候補を同定するためのScreenWorks Peak Proソフトウェアの利点を示しています。cisaprideのデータでは、拍動率の低下、減衰率の増加、および10%におけるピーク幅の増加が示されており、これらはすべてQT延長症候群の予測である可能性があるため、心臓安全性に影響を及ぼす可能性があります。創薬プロセスの早い段階でこれらのパラメーターを特定できれば、その化合物が前臨床試験の失敗候補であることを示す可能性があります。

HT細胞をベースとした予測アッセイ

より強力で安全な新薬の開発には、有効性と安全性を試験できるin vitroシステムが必要です。臨床では、心不全、頻脈、不整脈、その他の心疾患の治療に陽性および陰性クロノトロピーが使用されています。FLIPR Tetraシステムで実施されたアッセイから、いくつかの正性・負性クロノトロピンおよび既知のイオンチャネル遮断薬の心拍数への影響が示されました。EC50値は予想される範囲です（図4参照）。(図4参照）hERGチャネルブロッカーであるシサプリドを含むこの化合物群は、ScreenWorks Peak Proソフトウェアを使用して解析されました。Cisapride のデータでは、心筋に悪影響を及ぼす可能性のある指標である拍動速度の低下と 10%振幅でのピーク幅の増加が示されました。

結論

FLIPR Tetraシステムは、ScreenWorks Peak ProソフトウェアおよびFLIPR Calcium 5アッセイキットとともに、創薬プロセスの早い段階で心毒性化合物を排除し、潜在的な心疾患治療薬の候補を同定することで、創薬デザインを方向付けるための完全な統合ソリューションを提供します。