Application Note GenePix Proのスクリプト

A. スクリプト入門

ショーン・ハンドラン博士、ジャック・Y. Zhai, Ph.D., Sean Carriedo, Ph.D., and Damian Verdnik, Ph.D. Axon Instruments, Inc. 3280 ウィップル・ロード、ユニオン・シティ、CA 94587

最終更新日 2001年2月21日

スクリプトはGenePix Proの強力な機能であり、データの解析や表示、さらには取得や解析機能の自動化のための追加手段を提供します。スクリプトは、ハイパーテキストマークアップ言語（HTML）、Visual Basic（VBScript）、またはJavascriptで記述します。GenePix Proには、Reportタブの下にあり、埋め込みInternet Explorerブラウザページに表示される、すぐに使用できるスクリプトがいくつか含まれています。ヘルプボタンの下には、スクリプトに関する広範な情報と、GenePix Pro が多種多様なカスタムメイド操作を実行できるようにする独自のスクリプトを書くための優れたチュートリアルもあります。このアプリケーションノートでは、GenePix Pro に含まれるスクリプトのいくつかを簡単に説明し、GenePix の最新バージョンを使用していることを前提とします（GenePix Pro の最新バージョンにアップデートするには、ハードウェア診断ボタンを押します）。

特定のスクリプト（データを解析するスクリプトなど）が機能するためには、Resultsタブにデータがあるか、GenePix Resultsファイル（gpr）が開いている必要があります。自動収集タスクを実行するスクリプトでは、この要件は必要ありません。

B. 分析レポートスクリプトの説明

1. アレイの品質管理

このスクリプトは、多数のユーザー定義パラメーターを利用して、表、グラフ、ヒストグラムからなる包括的な統計解析を生成し、現在のマイクロアレイがユーザー指定の品質管理基準を満たしているかどうかを判定する。このスクリプトを実行する前に、ユーザーが手動で、またはFeature Quality Controlスクリプトを実行して、「Bad」フィーチャーを特定し、フラグを立てることを推奨する。

良好なマイクロアレイを示すためにユーザーが指定した閾値限界は以下の通りである：

1. SB比の最低レベル。
2. 最大許容背景強度レベル。
3. シグナル対ノイズ比の最小レベル。
4. 定義されたパーセンテージを超える飽和ピクセルを持つフィーチャーの数。
5. Not Found（見つからない）とフラグが立てられたフィーチャの最大パーセンテージ。
6. 「不良」とフラグが立てられたフィーチャの最大割合。

レポートの最初の表はマイクロアレイに関するサマリー情報を提供し、2番目の表は波長1と2の値がユーザーによって決定されたしきい値の限界に「合格」または「不合格」であったかを示します。最初の散布図は波長2対波長1のMean Intensitiesを示し、データの広がりを一目で表示し、対角線上または対角線近傍に位置するフィーチャーの数を示します。はみ出したFeatureは過剰発現または過小発現遺伝子を表す。2番目の散布図は対数比対中央値の和を表示する。

Log Ratioは発現のfold-changeを示し、Sum of Mediansは両チャンネルの合計シグナルを報告する。したがって、このプロットは、発現の変化が最も大きいフィーチャーが実質的なシグナルも持っているかどうかを決定する視覚的な手段を提供します。低いシグナル値を持つフィーチャーは、スプリアスに高いまたは低い比率値を持つ可能性があり、注意して解釈する必要があります。

次の2つのグラフは、X軸またはY軸に沿った各フィーチャーの位置に対して中央値の比率をプロットしたもので、スライドの系統的な品質管理の問題を決定する視覚的な手段を提供します。これには、スポット印刷、ハイブリダイゼーションのエラー、あるいは実験プロトコールに関連するその他の問題が含まれます。

さらに、Quality Controlレポートには、現在のマイクロアレイデータセットの全フィーチャーのフォールド発現変化の頻度分布を示すLog Ratio値のヒストグラムが表示されます。大半のフィーチャーはLog Ratio値がゼロ（発現に変化がないことを示す）を中心とするはずである。ヒストグラムの最頻値がゼロを中心としない場合は、PMTの設定の不均衡やハイブリダイゼーションの失敗など、現在のマイクロアレイに系統的なエラーがある可能性がある。

2. フィーチャー品質管理

このスクリプトは、フィーチャー内のピクセルのうち、ユーザーが設定したパーセンテージが、そのフィーチャーのバックグラウンド中央値の蛍光強度以下である場合、自動的にそのフィーチャーを「不良」と判定する。スクリプトのデフォルト設定は55%で、フィーチャー内のピクセルの55%がそのフィーチャーのバックグラウンド中央値よりも明るくない場合に、そのフィーチャーに「不良」のフラグを立てることを意味する。値が低いほど厳密ではなく、高いほど厳密である。

3. イメージマップ

このスクリプトは、フルオロフォア画像の Ratio 画像（Image タブの下にある）と付随する配列データ（Results タブで開いている必要がある）を組み合わせて新しい画像を生成します。ユーザーが新しい Report 画像の Feature の上にマウスカーソルを置くと、ToolTips ポップアップウィンドウが表示され、Feature の位置（Block、Row、Column 座標）、Feature の名前と ID、Feature の Ratio of Median と Regression Ratio、CY3 と CY5 チャンネルの Signal to Noise と Signal to Background 比値などの主要な Feature 情報が表示されます。フィーチャーをクリックすると、そのフィーチャーの ID が選択したウェブデータベースに送信されるように、現在のウェブアドレス（分析タブのオプションボタンで指定）へのハイパーリンクがアクティブになります。さらに、レポート画像は "Export "ボタンを使ってHTMLファイルとして保存できるので、ユーザーはウェブブラウザを使ってオフラインでアレイ画像とフィーチャープロパティを調べたり、インターネットやラボのイントラネットに画像を掲載することもできます。

4. 興味深い結果

このスクリプトは、ユーザーが選択した基準を使用して、潜在的に重大な活性変化を持つ印刷 物質を特定します。この分析では、一定レベル以上または以下の比率値の変化を検索し、3つの比率値（中央値の比率、比率の中央値、回帰比率）がすべて一定の割合内に収まるフィーチャーだけを選択します。これらのユーザー定義基準を満たしたフィーチャーは、視覚化しやすいように色分けされた表に一覧表示されます。このように、活性の上昇を示す赤色のシグナルを持つフィーチャーは、赤色のグラデーションで色分けされ、比率の高いものから順に赤色の明るい色合いで、比率の低いものから順に暗い色合いで表示されます。逆に、活動が低下していることを示す、より明るい緑色のシグナルを持つ特徴は、緑色のグラデーションで色分けされ、最も高いレベルの変化を持つ緑色の最も明るい色合いを持つ降順でリストされます。

nteresting Resultsスクリプトの主な目的は、さらなる調査に値する変化のある特徴を特定することです。そのため、Interesting Resultsスクリプトによって生成された結果のサブセットは、追加分析のためにさらに調べることができる。

5. データの正規化

このスクリプトは、ユーザーがマイクロアレイ間のデータをより簡単に比較できるように、ユーザー定義のパラメータでフィルタリングされたデータを調べ、データが正規化されたレポートを生成します。このレポートはカラムのソート機能を持つテーブルを構築し、遺伝子の ID または Name をクリックすると現在のウェブアドレスへのハイパーリンクがアクティブになり、フィーチャーの ID が選択されたウェブデータベースに送信されます。また、このレポートは、Microsoft Excelのようなデータベースプログラムに簡単にインポートできるタブ区切りのテキストファイルとして表をエクスポートすることができます。

6. SN比

単にマイクロアレイ画像を作成するだけでは、そのデータが解析に値する品質であることを保証するものではない。マイクロアレイのバックグラウンドの特性は、アレイ化されたスポットを検出し定量化する能力に大きな影響を与える可能性がある。バックグラウンドレベルが高いと、低発現遺伝子からのSB比が不明瞭になり、発現のわずかな変化を検出することが困難になる。

さらに、バックグラウンドが均一な視野であることはまれである。このようなシグナルの変動は「ノイズ」と呼ばれる。バックグラウンドノイズが大きいと、正確な定量が妨げられる。ノイズの起源にかかわらず、ノイズは通常、バックグラウンドピクセル値の標準偏差を計算することで定量化できます。GenePix Proはシグナル対ノイズ比（SNR）を次のように計算します：

SNR = (シグナル - バックグラウンド) / (バックグラウンドの標準偏差)

この計算は、無線、電子機器、画像処理など、多くの信号処理分野で一般的に使用されています。SNRは、バックグラウンドノイズを上回る信号を検出し、定量化できる信頼性を示します。

Signal-To-Noise Reportスクリプトは、マイクロアレイのSN比特性の統計的分析を表示することで、マイクロアレイ画像の全体的な品質を対物レンズで測定し、ユーザーがマイクロアレイから意味のあるデータを抽出できるかどうかを判断できるようにします。

C. ハードウェア診断とレポートスクリプト例

Hardware Diagnosticスクリプトは、ほとんど自明である。Exampleスクリプトは、マイクロアレイデータ解析を促進するスクリプトのパワーと可能性をさらに例示するために提供されている。これらのスクリプトは、ユーザーの研究ニーズをより満たすカスタムスクリプトを生成するための有用な出発点となるはずである。

D. レポートタブのカスタマイズ

GenePix Pro のスクリプト機能が非常に強力である主な理由は、データ取得および解析プロセ スを自動化するカスタムスクリプトの生成をユーザーが簡単に習得できることです。カスタムスクリプトを起動するには、Reports タブの「Open」ボタンをクリックし、スクリプトの場所を指定します（デフォルトの場所は GenePix3.0 フォルダ内の「Params」フォルダです）。ユーザーが書いたスクリプトを実行する便利な方法は、Reportsタブの "ホームページ "を変更することです。GenePix Proは埋め込みInternet Explorerブラウザページを通してレポートタブでスクリプトを実行するため、このページはHTMLコードを修正することで簡単にカスタマイズできます。GenePixアプリケーションを終了し、「Params」フォルダに移動して「default.htm」ファイルを探します。このファイルのバックアップコピーを作成し、Windowsオペレーティングシステムに含まれるNotePadアプリケーションを使用して開きます（Microsoft Wordはデフォルトの保存形式（*.doc）にHTMLに適さない書式設定があるため推奨されません）。次のHTMLコード（「Example Reports」のHTMLコードから直接「コピー」して「ペースト」したもの）をファイルの最後の3行の上に挿入し、ファイルの後半が次のようになるようにします：

<tr class="title">
 <td>
 <p class="heavy">The Title for My Script Report Section
 </td>
 </tr>

 <tr>
 <td>
 <ol style="font-family:Arial; font-size:10pt"> 
 <li><a href="Filename_for_Script1.htm">Title of Script #1</a>: Description of Script1.
 <li><a href="Filename_for_Script2.htm">Title of Script #2</a>: Description of Script2.
 <li><a href="Filename_for_Script3.htm">Title of Script #3</a>: Description of Script3.
 </ol>
 </td>
 </tr>
</table>
</body>
</html> 

アプリケーションに合わせて「BOLD」テキストをカスタマイズする。ファイルを保存し、GenePix Proを起動します。レポートタブにカスタマイズしたスクリプトが表示されます。

E. その他のリソース

このアプリケーションノートとスクリプトに関するチュートリアルが、GenePix Pro でのスクリプティングに関する実用的で有用な情報を提供できたことを願っています。また、http://groups.yahoo.com/group/axongenomics の axongenomics ディスカッショングループに参加されることをお勧めします。ここでは多くの GenePix ユーザーが購読しており、スクリプトの使用や開発に関する特異的な質問や回答を投稿しています。axongenomicsサーバーには、自由に配布できるカスタムメイドのGenePix Proスクリプトも多数封入されている。