Application Note マウス胚性幹細胞のクローン選択

はじめに

マウス胚性幹細胞（mESC）の培養や細胞株開発では、未分化細胞の標的を絞った増殖が特に重要である。ClonePix®システムの技術は、mESC培養、増殖、細胞株開発における特異性の課題に適している。このシステムは、白色光または蛍光を用いたmESCの自動ピッキングを可能にする。

後者は生存率染色であったり、ステージ特異的な細胞表面マーカーを検出するアッセイであったりするため、分化したmESCコロニーと多能性mESCコロニーを識別することができる。ClonePix®システム技術のこの応用は、幹細胞研究に以下のような利益をもたらす：

• 細胞株の維持：多能性マーカーを用いたクローン幹細胞の増殖の確保
• 細胞株開発：分化細胞に対するスクリーニング
• 遺伝子改変アッセイ：発生研究および遺伝子／幹細胞治療研究における挿入または欠失した遺伝子の発現検出
• 細胞ベースアッセイ：薬剤開発、毒性作用、細胞シグナリングとフィードバック経路

図1. 分化したCGR8 meS細胞と未分化のCGR8 meS細胞

分化した(A)と未分化(B)の細胞領域を示す、分化した大きなCGR8 mES細胞のコロニー。

細胞表面受容体マーカーを用いたmESCの蛍光イメージングと検出

多能性mESCに発現し、分化に伴って制御が低下するレセプターを蛍光アッセイでターゲットにし、ClonePixを使ってイメージングすることで、多能性を維持したまま細胞のコロニーを選択的にピッキングすることができる。その結果、ピッキングされた細胞はクローン性であるだけでなく、未分化であるため、さらなる増殖に適している。

同じ蛍光検出法を用いて、ClonePixは特定の細胞系譜や異種レセプターの特異性細胞表面マーカーなど、目的のタンパク質を発現している細胞を単離することもできる。

このような細胞表面マーカー（図2）のイメージングと検出は、目的の マーカーに対する蛍光結合抗体を用いて行うことができる。ClonePixイメージング・ソフトウェアシステムでは、ユーザーのニーズや結合抗体の入手状況に応じて、さまざまな蛍光色素をイメージングすることができる。さらに、蛍光イメージャーを白色光イメージングや最大4つの他の蛍光波長とマルチプレックスすることで、コロニーの形態、生存率、細胞周期のステージなどの追加要因を考慮することができる。

図2. 表面マーカーのイメージングと検出

多能性時にのみ発現するローダミン標識抗SSEA-1（Stage Specific Embryonic Antigen 1）を用いて多能性を検出するため、ClonePix®システムで付着増殖したCGR8 mESCのコロニーを蛍光イメージャーで撮影（カラー化画像、A）。青丸：ピッキングして増殖させるべき、まだ多能性の大きなコロニー。

細胞表面マーカーと下流の分化

上述の実験（図2、多能性マーカーSSEA-1に基づくアッセイ）により、ピッキング後の細胞のアウトグロースは良好であった。ピッキングされた細胞は、コロニーをピッキングする機械的作用や、SSEA-1レセプターへの抗体の結合の影響による分化レベルの上昇を示さなかった。図3からわかるように、元のコロニーからピッキングした細胞のクローン集団には、未分化の幹細胞がまだ存在していた（メインコロニーの中央の暗い部分）。図3はまた、96ウェルデスティネーションプレートにピッキングした後の良好な細胞増殖を示している。このことは、細胞系譜に影響を与えない抗体ベースアッセイの実現可能性を示している。しかしながら、蛍光標識抗体でアッセイされたセルをピッキングする効果は、新しい標的レセプターについて検証されるべきである

ピッキング後3日目（A）と4日目（B）のCGR8の成長。

方法

mESCの増殖とコロニーピッキング

セルは、2mLの適当な液体培地中で、6穴組織培養プレートのウェル当たり500個 の最終密度でプレーティングする。

コロニーは、約7～10日間かけて直径1～2 mmの大きさまで増殖させる。

最適な増殖を確保し、分化を避けるため、48時間ごとに培地を交換する。

蛍光アッセイを使用する場合、培地はイメージング／ピッキングの2～6時間前 に除去し、検出抗体（PBS／培地で希釈）を300μL加え、5分間インキュベー トして結合させる。その後、セルをさらに2mLの培地に重ね（抗体は除去せず）、2時間インキュベートする。

標準的な接着細胞ピッキング手順に従って、ClonePix®システムでコロニーをピッキングすることができます。

CloneMatrixベースの培地でのmESCの増殖と浮遊コロニーピッキング

図4に示すように、CGR8細胞はCloneMatrixベースの半固形培地（K8510）でも増殖させることができる。20%FCSと0.1M LIFを封じ込めたIMDM培地では、最良の増殖率と生存率が得られた。半固形培地に500cells/mLでセルを播種し、3-4日間増殖させ、図示のコロニーを得た。この方法を用いると、細胞を接着コロニーとして増殖させるよりも分化が少なくなる。これらの浮遊コロニーを抗SSEA1でマークし、ClonePix®システムでピッキングすることに成功した。

図4. ピッキング前後のCGR8細胞の成長。

抗SSEA-1染色（図2と同様）でプローブしたCloneMatrixベースの培地でのmES（CGR8）細胞のコロニーの成長と、コロニーの完全性を示すピッキング後の画像。A: 抗SSEA-1抗体で標識したCGR8細胞のClonePix®システム画像。明るい蛍光を持つ小さく丸い未分化コロニー（青矢印）と、より大きく不規則で淡い分化コロニー（赤矢印）を示す。B: CloneMatrix/GMEM半固形培地におけるCGR8の増殖。C: ピッキング後のCGR8コロニーで、クローン性と未分化の形態を示す。

結論

ClonePix®システムのユニークなテクノロジーをマウス胚性幹細胞のセレクションや増殖に応用することで、mES細胞の増殖に伴う手間のかかるボトルネックを取り除き、最も未分化なコロニーだけを確実に増殖させることができる。当社の半固形培地を使用することで、未分化のコロニー数が実際に増加し（おそらく細胞が何にも接着しないため）、効率がさらに向上する。したがって、ClonePix®システムは、多能性幹細胞株の増殖（多能性を示す蛍光マーカーの使用の有無にかかわらず）、あるいは当社独自の蛍光イメージングプロセスを使用した分化経路の下流での選択および細胞ベースアッセイのいずれにおいても、mES細胞研究のための強力なツールを提供します。

試薬および消耗品

このアプリケーションをサポートするため、Molecular Devices社は最適化された幅広い培地を取り揃えています。詳細はこちら

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