Application Note SPECTRAmax GEMINI マイクロプレート分光蛍光光度計を用いた
励起および発光波長の選択 - 基本原理

はじめに

最近まで、すべてのマイクロプレート分光蛍光光度計は、限られた数の励起／発光フィルターペアを備えたフィルターベースの装置であった。あるアプリケーションに対して、フィルターペアの波長は必ずしも蛍光体の最適な励起／発光波長と一致しなかった。入手可能な最良のフィルターは、蛍光体の最適波長から20nm、30nm、あるいは50nmも離れていることが多かった。既存のフィルターが使えない場合は、別のフィルターを購入して取り付ける必要があった。

SPECTRAmax GEMINI の導入により、バンドパスフィルターを使用したり、最適でない波長で妥協する必要がなくなりました。GEMINIには励起モノクロメーターと発光モノクロメーターが搭載されており、250～850 nmの波長の組み合わせが簡単に得られます。このような柔軟性を考えると、ユーザーは可能な限り最良の組み合わせを選択したいと思うのは当然である。特定の蛍光体について、その選択は、励起極大と発光極大の位置と、それらの間の分離（ストークスシフト）に依存する。2つの波長が離れている場合、選択は簡単である。励起極大と発光極大を選択し、適切なカットオフフィルターを用いて残留励起光を除去し、感度を最適化する。2つの波長が近接している場合、励起光のキャリーオーバーを最小限に抑える必要があるため、選択/最適化プロセスはそれほど単純ではありません。このアプリケーションノートでは、SPECTRAmax GEMINI マイクロプレート分光光度計の励起および発光波長を最適化するための基本的な手順を示します。比較的大きなストークスシフトを持つ蛍光体（キニーネ）への適用例を示します。

概要

蛍光分析法の開発における最初のステップは、励起波長を選択することである。次のステップは、可能な限り高いシグナル／バックグラウンド比を与える発光波長とカットオフフィルターの最適な組み合わせを選択することである。一般に、10-8Mから10-6Mの蛍光体を含むサンプルは十分なシグナルを与える。最適なシグナル／バックグラウンドの結果を得るためには、PMT（電圧）を最も高く設定してデータを取得すべきである。したがって、蛍光体の濃度は、検出器を飽和させることなく、高いPMTで発光スキャンを行うことができるように、十分に低くする必要があります。

手続き

A: マイクロプレートの調製

1. マイクロプレートの1つまたは複数のウェルに200µLの検体を、もう1つまたは複数のウェルに200µLの緩衝液または溶媒を入れます。

B: 励起波長の選択

1. SOFTmax PROで、カットオフフィルターなしの励起スキャン用のプレートセクションを設定し、中程度のPMT設定を使用します。
2. 発光波長は、文献の暫定値（または、蛍光体の測定に使用される一般的なフィルターセットの暫定値）に基づいて設定します。発光波長の文献値がない場合は、以下のセクションFのステップ5を参照)。
3. 励起スキャンは、文献（または慣用の励起フィルター）から得られた暫定的な励起 値の約30 nm下/上で開始/停止するように設定し、1～2 nmのステップ増分を使用する。
4. スキャンを実行し、ピークの励起波長（λmax）と最大RFU値を記録する。
5. 最適な励起波長を選択する。
   　励起波長λmaxと発光波長が80nm以上離れている場合は、励起波長としてλmaxを選択する。
   　励起波長と発光波長が 80 nm 未満しか離れていない場合、Molecular Devices 社は 90% の最大 RFU を示した
   　最低の励起波長を選択して分離を大きくすることを推奨します。

C: カットオフフィルターなしのエミッションスキャン

ほぼ間違いなくカットオフフィルターが必要になりますが、このスキャンはその後のエミッションスキャンを理解し解釈するのに役立ち、カットオフフィルターの選択に役立ちます。

1. SOFTmax PROで、カットオフフィルターなしのエミッションスキャン用のプレートセクションを設定し、高PMT設定を使用します。励起波長を上記の励起スキャンのステップ5で決定した値に設定します。
2. 文献（または既存のフィルターペア）から得られた暫定的なエミッション値から約50nm下/上でエミッションスキャンを開始/停止するように設定し、ステップ増分を1-2nmに設定する。スキャンを実行する。

D：発光波長とカットオフフィルターの選択

カットオフフィルターは、カットオフ波長以下の光を遮断し、カットオフ波長以上の光を透過させる。公称カットオフ値は、50％の透過が起こる波長です。発光カットオフフィルターは、試料からの蛍光シグナルを過度に減少させることなく、できるだけ残留する励起光を遮断するように選択する必要があります。カットオフ値は最大発光波長付近で、励起波長より少なくとも35 nm大きいことが望ましい。(好ましくは、カットオフ値は励起波長と発光波長の間にあるべきですが、非常に短いストークスシフトの場合、最適なカットオフフィルターは実際には発光最大波長よりも高いかもしれません！) SPECTRAmax GEMINIのカットオフフィルターの波長は、420, 435, 455, 475, 495, 515, 530, 550, 570, 590, 610, 630, 665, 695 nmから選択できます。

1. Emission Cutoff Filterを追加した以外は、上記のステップCと同様にして、2回目のエミッションスキャン用のプレートセクションをセットアップする。スキャンを行い、最大発光を示す波長を記録する。ブランクからのプロットをチェックし、その領域に予期せぬ蛍光がないことを確認する。サンプルに最大発光を与える波長が、選択したカットオフフィルターの最適発光波長となります。

E：異なるカットオフフィルターによるエミッションスキャン（オプション）

カットオフフィルターの選択に確信が持てない場合は、1つ以上の異なるカットオフフィルター（または励起波長とカットオフフィルターの組み合わせ）を用いて、エミッションスキャンを繰り返すとよいでしょう。必要であれば、シグナル/バックグラウンドのプロットを作成し、判断の助けとする（Maxline App. Note #31参照）

F: コメント

1. 最大発光波長は必ずしもシグナル／バックグラウンド比の高い波長とは限りません。ブランクに含まれる可能性のある蛍光によっては、Optimal Emission Wavelengthは最大発光波長からずれることがあります。
2. 一旦発光波長が指定されると、"Autofilter "機能は一般的に上記の最適化方法で使用された波長と同じカットオフフィルター波長を選択します。
3. 発光波長が420nm未満の場合、最適な発光波長と励起波長は、実験の反復によって決定するのが最善である。420nmのカットオフフィルターまたはカットオフフィルターなしで、発光波長と励起波長の組み合わせを試してください。同様に、励起波長が660ナノメートルを超える場合は、695 nmのカットオフフィルターを使用するか、カットオフフィルターを使用せずに、発光と励起波長の組み合わせを試してください。
4. 蛍光体のストークスシフトが極端に狭い場合は、90% max値よりもさらに低い励起波長を用いて、発光スキャンを繰り返すとよい。
5. 発光波長が不明な場合は、暫定的な発光波長を選択する。
   発光波長が不明な場合は、フルオロフォアの吸光度極大値より約50 nm大きい暫定的な発光波長を選択する。吸光度の最大値は、UV/Vis 分光光度計でスペクトルスキャン（より濃縮 したフルオロフォア溶液）を行うことで

0.01 N HClに溶解した1.24 µM硫酸キニーネを用いた最適化手順の例。

励起スキャンでは、初期発光波長が発光極大に近くなくてもこの方法が機能することを示すために、初期発光波長を任意に500 nmに設定した。300～400 nmの励起スキャンの結果、約350 nmに励起ピークが現れた（図1）

励起波長と発光ピークの間の分離は80nm以上であったため、励起波長は350nmとした。次に、まずカットオフフィルターなしで、次に3つの異なるカットオフフィルターを用いて、発光スキャンを行った（図2）。カットオフフィルターなしの場合、発光の最大値は443nmで約500RFUであった。カットオフフィルターはピークを徐々に右にシフトさせ、最大シグナルを減少させた。特に455 nmのカットオフフィルターはピークのほとんどをブロックした。

420 nmフィルターを用いたプロットは、435 nmフィルターを用いたプロットよりもかなり高かったが、420 nmフィルターを選択する前に、ブランク溶液（0.01 N HCl）のスキャンをチェックすることが重要であった（図3）。予想通り、カットオフフィルターなしのスキャンが、励起光の散乱のため最も高いシグナルを示した。420 nmのプロットは、約460 nmまでは435 nmのプロットより高く、それ以上では基本的に同じであった。

最終的な決定プロセスは、発光波長の関数としてのシグナル／バックグラウンド比のプロットを 作成することによって容易になった。(これらのプロットに必要な公式は、SOFTmax PRO Formula Reference GuideおよびMAXline App. Note No.31にも記載されている)。420 nmのカットオフフィルターのシグナル／バックグラウンドのプロットを図4に示す（435 nmのフィルターからのプロットはわずかに、しかし一貫して低かった）

GEMINIでの硫酸キニーネの分析に最適な波長設定は、420 nmカットオフフィルター付きの350/470（Ex/Em）に選ばれました。

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