Application Note 表面機能化ナノ粒子のスペクトルシグネチャー分析
- コーティングされていないナノ粒子とコーティングされたナノ粒子のスペクトル特性の変化を容易に検出
- ナノ粒子の表面官能基化をモニター
- スペクトル最適化ウィザードによるスペクトルシグネチャーの自動分析
PDF版（英語）
ミランダ・N・ハースト、ロバート・K・デロング博士（カンザス州立ナノテクノロジーイノベーションセンター（NICKS）、カンザス州立大学獣医学部解剖生理学教室）。
はじめに
ナノテクノロジーは急速に発展している分野であり、生物医学研究への応用の可能性から科学界の関心を集めています。ナノ材料の直径は通常100nm以下であり、哺乳類細胞を透過するのに十分な大きさです。ナノ材料は、ロッド、チューブ、粒子など様々な形状で、また金属、金属酸化物、これらの組み合わせなど様々な元素組成で合成することができます。体積に対する表面積の割合が大きいため、表面機能化に適しており、標的分子や治療分子を付着させることができます。ナノ粒子が全身に送達される場合、付着したターゲティング分子によって腫瘍細胞などの特定の細胞集団の検出が可能になり、一方、付着した治療用化合物はターゲティングされた細胞に作用することができます。
ナノ粒子が構成する材料には特異性のバンドギャップ、つまり電子の基底状態と励起状態の間の距離があります。一般に、電子は基底状態、つまり最もエネルギーの低い状態に存在します。光子や光エネルギーを吸収すると、電子は励起エネルギー状態に移行します。基底状態と励起状態の間の距離はバンドギャップとして知られています。ナノ粒子材料は1つ以上の特異性波長を吸収し、吸収されたエネルギーの一部は振動エネルギーとして失われ、残りの余剰エネルギーは蛍光光として放出され、電子は基底状態に戻ります。異なる励起波長と発光波長の範囲にわたって相対蛍光強度をプロットすることにより、固有のスペクトルシグネチャーを得ることができます。
現在、ナノ粒子とその分子間相互作用の特性評価に利用できる技術は限られています。ここでは、ナノ粒子と表面コーティング分子間の相互作用を確認する方法として、スペクトルシグネチャー分析を提案します。他の分子と表面相互作用すると、ナノ粒子材料の電子的特性が変化し、その結果、蛍光の励起および発光のピーク波長、すなわちスペクトル・シグネチャがシフトします。表面コーティングされたナノ粒子とコーティングされていないナノ粒子のスペクトル・シグネチャーを比較することで、静電相互作用を示すスペクトル・シグネチャーのシフトを明らかにすることができます。
ここでは、SpectraMax®i3xマルチモードマイクロプレートリーダーとSoftMax®ProソフトウェアのSpectral Optimization Wizardを使用して、どのようにスペクトルシグネチャー解析を行うかを紹介します。
Spectral Optimization Wizardは、ユーザーが定義した範囲の励起・発光波長ペアの自動スキャンを可能にします。各波長ペアの蛍光値はヒートマップとしてプロットされ、コントロールに対して最も高いシグナルを発生する波長ペアを示す「ホットスポット」が表示されます。これらのホットスポットを異なるサンプルについて比較することで、スペクトルシフトを同定することができます。
図1. ナノ粒子の表面機能化の図。左：元のナノ粒子。右：薬物、抗体、核酸を含むさまざまな標的分子の結合を可能にする表面官能基化を施したナノ粒子。
材料
- 酸化鉄（III）ナノ粒子（PlasmaChem社製、商品番号PL-FeO）
- 酸化亜鉛ナノパウダー、<100 nmサイズ（Sigma Aldrich社、カタログ番号#544906-10G）
- メトキシポリ（エチレングリコール）（mPEG 5000、Sigma Aldrichのカタログ番号#81323-250G）
- 超純水
- 黒色96ウェルマイクロプレート（Greiner cat.#655076）
- SpectraMax i3xマルチモードマイクロプレートリーダー
方法
ナノ粒子の調製
酸化鉄ナノ粒子（Fe2O3NP）を分析天秤で2 mgを微量遠心管に秤量し、1 mLの超純水に懸濁して最終ストック濃度を2 mg/mLとしました。このストック濃度をボルテックスして粒子を分散させました。最終試料濃度1 mg/mLを得るため、ストック100 µLを新しい微量遠心管に移し、超純水100 µLを加えてナノ粒子対照試料としました。この200μLサンプルをボルテックスし、黒色96ウェルマイクロプレートの1ウェルに移しました。
酸化亜鉛ナノ粒子（ZnO NP）を分析天秤で3.5 mg秤量し、微量遠心チューブに入れ、1 mLの超純水に懸濁して3.5 mg/mLのストック濃度としました。この溶液をボルテックスし、57 µLのストック溶液を新しい微量遠心チューブに移しました。このチューブに143 µLの超純水を加えて容量を200 µLにし、最終試料濃度を1 mg/mLにしました。このサンプルをボルテックスし、ナノ粒子コントロールとして黒色96ウェルマイクロプレートの1ウェルに移しました。
ナノ粒子表面の機能化
2本の新しい微量遠心チューブに、100 µLのFe2O3NPストック溶液または57 µLのZnO NPストック溶液を加えました。分析物天秤でmPEGを4 mgまで秤量し、1 mLの超純水に懸濁して最終濃度を4 mg/mLとしました。このmPEGストック溶液をボルテックスし、50μLを各マイクロチューブに移しました。Fe2O3NP-mPEG試料には50μLの超純水を加え、ZnO NP-mPEG試料には93μLの超純水を加えて、試料を最終容量の200μLにしました。その後、サンプルをボルテックスし、黒の96ウェルマイクロプレートに移しました。サンプルは、表面コーティングを確実にするため、読み取り前にマイクロプレート内で30分間インキュベートしました。
蛍光検出
96ウェルマイクロプレート内のサンプルの蛍光を、表1に示す設定を用いてSpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーで検出しました。予備的な蛍光スペクトルスキャンを、mPEG の有無にかかわらず、Fe2O3NP では 260 nm、ZnO NP では 350 nm の励起波長を用いて行いました。発光は、Fe2O3NP試料では295 nmから750 nmまで5 nm間隔で測定し、ZnO NP試料では375 nmから750 nmまで5 nm間隔で測定した（表1）。マイクロプレートは、測定前に高速で環状に5秒間振りました。
| 鉄 2 O 3 NP +/- mPEG |
ZnO NP +/- mPEG | |
|---|---|---|
| 光学構成 | モノクロメーター | モノクロメーター |
| 読み取りモード | 蛍光 | 蛍光 |
| 読み取りタイプ | スペクトル | スペクトル |
| 波長 |
励起: 260 nm 発光開始 295 nm 発光停止：750 nm ステップ：5nm |
励起： 350 nm 発光開始 375 nm 発光停止：750nm ステップ：5 nm |
| 読み取り高さ (mm) | 1 | 1 |
| フラッシュ/リード | 6 | 6 |
| PMT & 光学系 | オート | オート |
| 読み取りエリア | トップ | トップ |
表1. SoftMax® Proソフトウェアでの予備スペクトルスキャンの設定。
この初期検証の後、Spectral Optimization Wizard（SOW）を使用して、ユーザーが指定した励起および発光波長範囲で一連の蛍光リードを実行し、そこから各サンプルに最適な波長ペアを特定しました。SOWは、表2に示す設定を選択することで開始しました。Readを選択すると、新しいダイアログボックスが表示され、ユーザーがテストする励起波長とEmission波長の範囲を選択します。スキャンする励起波長の範囲は250～500 nm、スキャンするEmission波長の範囲は300～700 nmに設定しました。Fe2O3NPサンプルでは10 nmステップ、ZnO NPサンプルでは5 nmステップを選択しました。すべてのサンプルについて、デフォルトの読み取り高さ1 mmを使用しました。セットアップ・ダイアログ・ボックスを図2に示します。
| 光学構成 | モノクロメーター |
|---|---|
| 読み取りモード | 蛍光 |
| 読み取りタイプ | エンドポイント測定 |
| 波長 | 不明 |
表2. SoftMax® Proソフトウェアのスペクトル最適化ウィザードの開始を促す設定。
図2. ナノ粒子のスペクトル最適化ウィザード設定。mPEGあり/なしのFe2O3およびZnO NPサンプルに使用した設定。ZnO NPサンプルでは、5 nmの波長増分を使用しました。
データ取得
Spectral Optimization Wizardは、サンプルの最適な励起およびEmission波長を特定し、その後のプレーティングでこれらの波長を使用するように設計されています。このソフトウェアは、ヒートマップとそれに関連する蛍光値を自動的にデータとして保存しません。しかし、ヒートマップウインドウが開いている間は、ヒートマップ上で右クリックし、'Copy Raw Data'を選択することで、このローデータをコピー＆ペーストすることができます。データをスプレッドシートに貼り付ける場合、スペクトルの最適化で使用する励起波長と発光波長は、ローデータ値とともに自動的にエクスポートされないため、手動で入力する必要があります。SoftMax Proソフトウェアで作成したオリジナルのヒートマップ画像は、右クリックして「名前を付けて画像を保存」を選択することで、参照用に保存することができます。
結果
Fe2O3NPは、励起260 nm、発光580 nm、蛍光強度10.1K相対蛍光単位のスペクトルを示しました（図3、上）。mPEGの存在下では、Fe2O3NPは励起270 nm、発光570 nm、蛍光強度5.1Kのスペクトルを示しました（図3、下）。Fe2O3NPをネガティブコントロールとして用いると、mPEG存在下で励起とEmissionのWavelengthに10nmのシフトが観察されました。しかし、これらのスペクトルシグネチャーを導出するために10 nmステップを用いたことから、このシフトは無視できるものであり、むしろ測定のばらつきの結果です。しかし、蛍光強度が約半分に減少していることから、平衡状態で会合・解離し、蛍光消光が起こるとしても、何らかの小さな相互作用があることが示唆されます。
図3. Fe2O3NP（上）とmPEG表面官能基化Fe2O3NP（下）のスペクトルシグネチャー。ソフトウェアによって特定された最適波長ペアは、励起対Emission波長の各ヒートマップ上に赤い「ホットスポット」として表示されます。ヒートマップのグレーの部分は、ソフトウェアによって回避される非実現可能な波長の組み合わせを表します。黒い部分は、蛍光シグナルがSB比に非常に近い測定値を示しています。
比較的、ZnO NPは、励起波長390 nm、発光670 nm、蛍光強度13K相対蛍光単位のスペクトルを示しました（図4、上）。mPEGの存在下では、ZnO NPは励起波長380 nm、発光波長695 nm、蛍光強度95.6K相対光単位のスペクトルを示しました（図4、下）。ZnO NPは、5 nmのステップを使用した場合、mPEGの存在下でスペクトルシグネチャーのEmission波長に25 nmのシフトを示しました。これは、表面原子の電子的特性がmPEGポリマーの存在下での結合によって変化しているため、相互作用があることを示しています。コーティングされたナノ粒子の蛍光の増強は、ポリマーが材料内の酸素分子と相互作用していることを示しています。表3は、得られたスペクトルの特徴をまとめたものです。
図4. ZnO NP（上）とmPEG表面機能化ZnO NP（下）のスペクトルシグネチャー。非コーティングナノ粒子とコーティングナノ粒子では、最適化された波長ペアにおいて有意なシフトが確認されています。
| 表面コーティング | 分光シグネチャー（Ex/Em） | |
|---|---|---|
| FeO | ZnO | |
| なし | 260 nm/580 nm | 390 nm/670 nm |
| mPEG | 270 nm/570 nm | 380 nm/695 nm |
表3. mPEGの有無によるFeOとZnO NPのスペクトルシグネチャー。SoftMax ProソフトウェアのSpectral Optimization Wizardを用いて最適化した波長ペアを示しています。mPEGを添加した場合、FeO NPのスペクトルシグネチャーはわずかにシフトするだけであるが、ZnO NPはmPEG添加により25nmのシフトを示しています。
結論
励起波長とEmission波長の20nmのシフトは、ZnO NPとmPEGポリマー間の静電相互作用と複合化を示しており、これはmPEG存在下のFe2O3NPでは観察できませんでした。ナノ粒子とその表面相互作用のこの特性は、SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーとSoftMax ProソフトウェアのSpectral Optimization Wizardを使用して検出できます。この手法により、ナノ粒子の表面機能化を行う際の品質管理と保証が可能になります。さらに、この技術は、標的治療化合物の送達手段としてナノ粒子を利用する医薬品開発において、正しい製品形成を保証するために拡張することができます。
SpectraMax i3xマルチモード検出プラットフォームについてさらに詳しく >>
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