Application Note Spectramax Gemini XS マイクロプレートリーダーを用いた
安定性がある高感度蛍光ベースのサイクリックAMP測定法

はじめに

Abbie Esterman, Jayne Hesley and Anne T. Ferguson：モレキュラーデバイス

アデノシン3´, 5´-サイクリック一リン酸（サイクリックAMP、cAMP）は、細胞表面レセプターによって検出される細胞外環境の変化を核内の変化に結びつけ、遺伝子発現パターンの変化をもたらす普遍的な二次メッセンジャーです。バクテリア、粘菌、ミバエ、ヒトなど多様な生物において、細胞内および細胞間のシグナル伝達に関与しています。サイクリックAMPはアデニル酸シクラーゼ（AC）という酵素によってATPから産生され、サイクリックAMPホスホジエステラーゼによって加水分解されます。これらの酵素の活性化により、細胞内のcAMPレベルを厳密に制御することができます。

哺乳類では、ペプチドホルモンや神経伝達物質などの細胞外リガンドは、G共役受容体（GPCR）と呼ばれる膜貫通タンパク質と相互作用します。リガンドの結合は受容体の構造変化を引き起こし、GTP結合制御タンパク質（Gタンパク質）との結合を可能にします。G共役型受容体は、刺激型Gタンパク質であるGsと結合するとACを活性化し、抑制型Gタンパク質であるGiと結合すると酵素を阻害します。Gs共役型受容体が活性化するとcAMPの産生が増加し、サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼまたはPKAが活性化されます。この酵素は様々なタンパク質をリン酸化し、最終的に転写因子の活性を調節し、遺伝子発現に影響を与えます。PKAの標的には、他の酵素、イオンチャネル、転写調節因子などが含まれます *1。さらに、cAMPは転写因子であるcAMP-responsive element-binding protein（CREB）、すなわちcAMP誘導性遺伝子の発現を調節する役割を果たすタンパク質と結合し、その活性を増強することによって、転写に直接的な役割を果たします *2。

細胞の種類にもよりますが、このシグナル伝達経路は、神経や免疫反応、代謝、有糸分裂、卵子の成熟、ミバエの嗅覚、植物の受精や種子形成、その他多くの重要な機能を担っている可能性があります *1-7。したがって、cAMPのレベルをモニターすることは、シグナル伝達経路の上流成分の作用機序の理解に役立ち、シグナル伝達経路を活性化または阻害する薬剤のスクリーニングとして使用することができます。

このアプリケーションノートでは、ヒト胚性腎臓細胞株 HEK 293 を用いて、フォルスコリンおよびイソプロテレノールによって誘導される細胞内 cAMP レベルの変化を調べるための、モレキュラーデバイス製 SpectraMax® GEMINI XS マイクロプレートリーダーの使用についてご説明します。これらの細胞は、新しい競合イムノアッセイであるCatchPoint™ cAMP Fluorescent Assay Kitの性能を調べるためのモデル系です。キットには、ヤギ抗ウサギIgG抗体でコートされた384ウェルマイクロプレートが2枚付属しています（図1、ステップ1）。cAMP、cAMPキャリブレーター（標準品）または陰性対照を含む検体を、一次抗体およびcAMP-ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（cAMP-HRP）結合体とインキュベートし、特異的な結合相互作用が起こるようにします（図1、ステップ2）。サンプルまたは標準品中のサイクリックAMPはウサギ抗cAMP抗体と結合する際、cAMP-HRPコンジュゲートと競合します。

サンプル中のcAMP量が増加すると、マイクロプレートウェルの底に結合するcAMP-HRP結合体の量は減少します。未結合の結合体は、1回の洗浄操作でウェルから除去されます（図 1、ステップ2）。手順の最後のステップは、ウェルの内容物をStoplight Red™ 基質とインキュベートすることです。一次抗体に結合した cAMP が多ければ多いほど、ウェルに残る cAMP-HRP 結合体の量は少なくなり、SpectraMax Gemini XS マイクロプレートリーダーで検出されるストップライト・レッドの蛍光シグナルは低くなります（図 1、ステップ 3）。これにより、図 3 の cAMP キャリブレーターに見られるような用量反応曲線が生成されます。

材料

1. 細胞 HEK 293細胞（アデノウイルスE1Aタンパク質を安定的に過剰発現するヒト胚性腎臓細胞）。
2. 試薬 凍結乾燥cAMPキャリブレーター、ウサギ抗cAMP抗体、HRP-cAMP結合体、Stoplight Red™基質を含むCatchPoint cAMP Fluorescent Assay Kit（モレキュラーデバイス, cat #R8044）。DMSO、低含水（Sigma）、炭酸水素ナトリウム（Sigma）、フォルスコリン（Sigma）およびイソプロテレノール（Sigma）を含むcAMPアゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤、3-イソブチル-1-メチルキサンチンまたはIBMX（Sigma）および30％過酸化水素（H₂O₂）溶液（Sigma）。
3. マイクロプレート：コーティングされた384ウェル、黒色固形アッセイマイクロプレート（キットに付属）、384ウェル、透明、非滅菌ポリスチレンマイクロプレート（Greiner）。
4. 培地とバッファー Dulbecco's modified Eagles medium, DMEM (Irvine Scientific), 0.526 mM EDTA in PBS (Irvine Scientific), phosphate buffered saline, PBS (Invitrogen™ Life Technologies), Krebs-Ringer bicarbonate buffer (KRBG buffer) (Sigma). Cell Lysis Buffer pH 7.3、cAMP Assay Buffer pH 5.8、10X Wash Solution はすべてキットに付属しています。
5. Fetal bovine serum: (FBS) heat inactivated (Irvine Scientific)。

試薬の調製

1. 細胞増殖培地： 10%FBS添加DMEM
2.  KRGBバッファー： シグマ社の製品情報シートに、このバッファーの詳しい調製方法が記載されています。
3. 800 mM IBMX：100mgのIBMXを563μLのDMSOに溶解します。20℃で保存します。IBMX は cAMP ホスホジエステラーゼによる cAMP の分解を阻害します。
4. プレ刺激バッファー：KRGBバッファー10 mLに800 mM IBMX 9.4 µLを加えます。IBMXが完全に溶解するように激しくボルテックスします。このバッファー は実験当日に新しく調製します。
5. 10 mM イソプロテレノール：24.8 mg を 10 mL の蒸留水に溶解します。20℃で保存します。希釈液はPBSを用いて調製します。
6. 10 mM フォルスコリン：10 mg を 2.4 mL の DMSO に溶かします。20℃で乾燥保存します。希釈液はPBSを用いて調製します。
7. cAMPキャリブレーター：凍結乾燥キャリブレーター1バイアルを1.25mLのPBSに再溶解します。表2に示すように、cAMPアッセイバッファーでさらに希釈します。よく混ぜて溶解させます。氷上または4℃で2週間まで保存します。
8. 凍結乾燥ウサギ抗cAMP抗体およびHRP-cAMPコンジュゲート： 凍結乾燥抗体およびコンジュゲート1バイアルを10mLのcAMPアッセイバッファーに溶解し、よく混和し、氷上または4℃で2週間保存します。
9. 3% H₂O₂：30%H₂O₂溶液を脱イオン水で10倍に希釈します。
10. 1X洗浄液：10X洗浄液を脱イオン水で10倍に希釈します。
11. Stoplight Red溶液：22 mLのSubstrate Bufferに25 µLの3% H₂O₂を加えてStoplight Red溶液を調製します。よく混合し、220 µL の 100X Stoplight Red 基質を加えてStoplight Red溶液とします。この溶液はプレーティング直前に調製することが重要です。

方法

細胞調製

HEK 293細胞をT-75フラスコ中、10%ウシ胎児血清添加DMEM中、37℃、5% CO₂で約80%コンフルエンスまで増殖させました。

ステップ1 T-75フラスコ1本の細胞をPBSで1回洗浄した後、PBS中0.526mM EDTA 3mLで37℃、5～10分間処理しました。

ステップ2 剥離した細胞をトリチュレートして単一細胞懸濁液とし、10% FBSを含む培地7 mLを封じ込めたチューブに移しました。ヘマサイトメーターを用いて細胞をカウントするためにアリコートを取り出し、実験に利用可能な総細胞数を決定しました。

ステップ3 細胞を卓上遠心機で1100rpm、5分間回転させ、KRBGバッファーで1回洗浄しました。その後、細胞をPrestimulation Bufferに1 x 106 cells/mLの濃度で再懸濁しました。

ステップ4 cAMPキャリブレーター標準曲線用に、384ウェル透明ポリスチレ ン製マイクロプレートの1ウェルを用意しました。これらのウェルに7.5マイクロリットルの刺激前バッファーを加えました。他のウェルには、7.5μL/ウェル（7.5×103個/ウェル）の 容量で細胞を播種しました。

ステップ5 384ウェルマイクロプレートを室温で10分間インキュベートしました。

アッセイ手順

ステップ1 cAMPキャリブレーターとアゴニストの希釈液を表1および表2に従って調製しました。細胞を刺激してcAMPを産生させるため、7.5 µLの細胞を封じ込めたマイクロプレートのウェルに、15 µL量のアゴニスト（フォルスコリンまたはイソプロテレノール）またはPBS（陰性対照）を添加しました。環状AMPキャリブレーター希釈液を、刺激前バッファーだけを含むウェルに加えました。各サンプルは8反復で行いました。サンプルは穏やかに混合され、37℃で15分間、5% CO₂でインキュベートされました。

表1： 細胞を用いた実験に使用したアゴニストの用量。1 細胞とアゴニストのみを封じ込めた22.5 µL容量中のアゴニストの濃度

表2： 標準用量反応曲線の作成に使用したcAMPキャリブレーターの用量。1 60µLアッセイ容量中の最終濃度。

ステップ2 細胞を溶解するため、7.5µLのCell Lysis Bufferをすべてのウェルに添加し、プレートシェーカーを用いてマイクロプレートを室温で10分間撹拌しました。

ステップ3 マルチチャンネルピペッターを用いて、各ウェルから20µLずつ分注し、384ウェル黒色固形アッセイマイクロプ レートの別々のウェルに移しました。アッセイプレートウェルのレジストレーションはポリスチレンプレートと同じにしました。

ステップ4 再構成したウサギ抗cAMP抗体20μlをすべてのウェルに添加しました。マイクロプレートをプレートシェーカーで5分間静かに撹拌し、適切なプレーティングを確保しました。

ステップ5 再構成したHRP-cAMPコンジュゲート20μlをマイクロプレートの全ウェルに添加し、穏やかに混合しました。その後、室温で2時間インキュベートしました。

ステップ 6 インキュベーションが完了したら、アッセイマイクロプレートを 80μL/well の 1X Wash Buffer で 4 回洗浄しました。

ステップ7 Stoplight Red溶液を調製しました。50μLのStoplight Red溶液をマイクロプレートの各ウェルにできるだけ速やかに添加しました。マイクロプレートに蓋をし、遮光しました。

ステップ8 10分後と60分後に、以下の設定で蛍光強度を測定しました：

表3：CatchPointサイクリックAMPアッセイ用のSpectraMax Gemini XSマイクロプレートリーダーの設定。

結果

励起およびエミッション波長の最適化

PBSで希釈したStoplight Red基質のサンプルで励起および発光スペクトルスキャンを行い、PBS単独で得られた蛍光シグナルと比較しました。この手順を用いて、サイクリックAMP蛍光アッセイに最適な励起・発光波長とカットオフフィルターを決定しました（図2）。

アッセイ性能

サイクリックAMPキャリブレーター曲線

cAMPキャリブレーターを封じ込めた試料から得られたデータを解析した結果、図3に示すプロットが得られました。データは4パラメータカーブにフィット処理されました。この場合、C値（図3Aでは2.4 pmol/mL、図3Bでは3.7 pmol/mL）が曲線の中点、つまりEC₅₀値となりました。注目すべきは、10分後と60分後に読み取られたEC₅₀値が同程度であったことで、蛍光シグナルが経時的に相対的に安定していることが示されました。さらに、これらの値は、別の蛍光マイクロプレートリーダーAnalyst AD（3.4±0.6pmol/mL、製品添付文書参照）を用いて以前このキットで得られた値と一致していました。この実験を別の日に行ったところ、得られたEC₅₀値は3.4 pmol/mLであり、このアッセイが再現性に関して高品質であることが改めて示されました。SB比（キャリブレーターなし）は240で、検出限界（ゼロcAMPキャリブレーター対照からの3標準偏差差と定義）は0.1pmol/mL cAMPでした。アッセイの最適性能範囲は、検出可能なシグナルの最大値と最小値の間に位置します。これは0.14～33pmol/mLと決定されました。

Z´ factorの決定

Z´ factor値を決定するために実験を行いました。Z´ factorの値が0.5～1.0であれば、スクリーニング目的に適した高品質でロバスト性の高いアッセイであることを示します *8：

σc+は陽性対照の標準偏差、σcdenは陰性対照の標準偏差を表します。μc+-μc-｜という用語は、陽性対照の平均値と陰性対照の平均値の差の絶対値を示します。この場合、最大阻害を達成したcAMPキャリブレーター濃度（33pmol/mL）を陽性対照とし、最小阻害を達成したcAMPキャリブレーター濃度（0.14pmol/mL）を陰性対照としました。分光蛍光光度計 SpectraMax Gemini XS を用いた CatchPoint cAMP Fluorescent Assay Kitの Z´ factor は 0.84 でした。

フォルスコリンおよびイソプロテレノールに対するHEK 293細胞の反応

HEK 293細胞は、アデニル酸シクラーゼ活性の内因性レベルが低いため、cAMPの制御を研究するのに適したモデル系です *9。HEK 293細胞を、0～1 mMの範囲のフォルスコリンまたはイソプロテレノールで処理しました（図4、5）。イソプロテレノールはβアドレナリン受容体アゴニストです *9-10。フォルスコリンで得られたEC₅₀値は13μMで、これは他の製品で得られた値と同じです（NEN/Perkin Elmerの[FP]2™キット）。

イソプロテレノールで得られたEC₅₀値は82 nMであり、これは別の細胞株で得られた値と一致しました（図5A10）。同じEC₅₀値が、Stoplight Red基質と10分間インキュベートしただけで得られました（データは示さず）。ここでもまた、このアッセイの蛍光シグナルの安定性が裏付けられました。SoftMax Pro®ソフトウェアを用いて、図3に示した標準曲線に対してデータを補間し、図5Bのグラフを得ました。

結論

モレキュラーデバイスのCatchPoint cAMP Fluorescent Assay KitとSpectraMax Gemini XSマイクロプレートリーダーは、基礎研究および医薬品開発を目的として細胞内cAMPの変化をモニターするための補完的なツールセットをご提供します。シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ（SPA）やラジオイムノアッセイ（RIA）のようなcAMP検出のための放射性メソッドと比較して、この蛍光ベースのアッセイは高速で、コストのかかる廃棄物のクリーンアップや除去が不要であり、少なくとも10倍の高感度です。具体的には、SPAの典型的な感度は非アセチル化型cAMPで2 pmol/mLであるのに対し、CatchPointアッセイキットでは0.1 pmol/mLです。さらに、CatchPointアッセイキットは蛍光偏光法によるcAMP測定（1.25pmol/mL）よりも約10倍感度が高いです。

アッセイ完了のスピードと感度の点で、発光アッセイキットはCatchPoint cAMP Fluorescent Assay Kitの4倍感度が低く、シグナル検出のための特別な設定も必要です。最後に、安定したシグナルに到達するのに必要なインキュベーション時間が短い（10分から24時間）ため、CatchPointアッセイキットはハイスループットスクリーニングに最適です（図3およびイソプロテレノールのデータ）。注目すべきことに、このキットは、繰り返し試験した際に得られたcAMPキャリブレーターのEC₅₀値のZ´ factorと再現性によって示されるように、高品質のスクリーニングアッセイを提供します。結論として、CatchPoint cAMP Fluorescent Assay Kitは、簡単な手順で利用できます、現在市販されている細胞内cAMP測定試薬の中で最も高感度なものの一つです。

参考文献

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