Application Note 蛍光を利用した安定で高感度なサイクリックGMP測定法

はじめに

Janet Daijo , Anne T. Ferguson：モレキュラーデバイス, David Morton：Sunnyvale, CA, USA. 2 オレゴン健康科学大学、オレゴン州ポートランド Email: mortonda@ohsu.edu

3´, 5´環状グアノシン一リン酸（cGMP）は、シグナル伝達経路における二次メッセンジャーであり、酵素グアニリルシクラーゼ（GC）によって産生されます。サイクリックGMPシグナル伝達は、平滑筋の弛緩、陰茎の勃起、腎機能、炎症反応など多くの生理的反応において重要です *1, *2, *3。また、脊椎動物と無脊椎動物の光伝達には、グアニル酸シクラーゼ活性を制御するシグナル伝達経路が関与しています *4, *5。

本報告では、新しいcGMPアッセイ（CatchPoint™ cGMP Fluorescent Assay Kit）を用いて、2つのモデル系でGC活性を測定した結果を示します。最初のモデル系は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）*6, *7というポリペプチドホルモンによるGCの活性化です。このホルモンは脊椎動物の多くの種に見られ、血圧上昇に反応して放出されます。ANPは、腎臓からのナトリウムと水分の排泄を促し、血管平滑筋を弛緩させることによって血圧を下げます。私達は、ラット肺線維芽細胞株RFL-6におけるANPの活性を研究しています。

二つ目のモデル系では、タバコの角虫Manduca sexta 8-10の中枢神経系に局在する新規GC、MsGC-β3の活性を研究しています。NOによるヘテロ二量体形成と活性化を必要とする他の可溶性GCとは異なり、MsGC-β3は、COS-7細胞で単独発現させると高い基礎活性を示し、一酸化窒素存在下ではわずかな刺激しか示さないという点でユニークです *9。

これら2つのモデル系でcGMPを測定するために使用されるcGMPアッセイは、モレキュラーデバイスのCatchPoint cGMP Fluorescent Assay Kit（cat #R 8044, R 8053）と同じ原理に基づく競合イムノアッセイです。つまり、サンプル中のcGMP量が増加すると、蛍光シグナル出力は減少します。本レポートでは、本アッセイの高感度、高信頼性、簡便性を示します。

材料

1. 細胞 RFL-6ラット肺線維芽細胞（ATCC）は、20%ウシ胎児血清、グルタミン（2 mM）、ペニシリン（50 U/mL）およびストレプトマイシン（10 mg/mL）を添加したHam's F-12培地で増殖させました。COS-7サル腎臓細胞（ATCC）は、10％FCS添加DMEMで培養しました。
2. 試薬 凍結乾燥cGMPキャリブレーター、ウサギ抗cGMP抗体、HRP-cGMPコンジュゲートおよびStoplight Red™基質を含むCatchPoint cGMP Fluorescent Assay Kit（モレキュラーデバイス、cat #R8074、96ウェルアッセイキット）、炭酸水素ナトリウム（Sigma）、ヒトANP（Sigma）、ウシ血清アルブミン、BSA30％（Sigma）、ホスホジエステラーゼ阻害剤、3-イソブチル-1-メチルキサンチンまたはIBMX（Sigma）、EDTAを含まない完全プロテアーゼ阻害剤（Roche Applied Science）および30％過酸化水素（H202）溶液（Sigma）。
3. マイクロプレート。コート済み黒壁透明底96ウェルマイクロプレート（キットに付属）、12ウェル透明組織培養処理マイクロプレート（VWR）。
4. 培地とバッファー Ham's F-12 medium (Irvine Scientific), DMEM (Irvine Scientific), fetal bovine serum (Irvine Scientific), glutamine pen-strep solution (Irvine Scientific), Krebs-Ringer bicarbonate buffer (KRGB buffer) (Sigma), M-PER mammalian cell extraction reagent (Pierce）、リン酸緩衝生理食塩水、PBS（Invitrogen™ Life Technologies）。Cell Lysis Buffer (pH 7.3)、cGMP Assay Buffer (pH 5.8)、10X Wash Solution はすべてキットに付属しています。

試薬の調製

表1： 標準用量反応曲線の作成に使用したcGMPキャリブレーターの用量。1アッセイ容量120 µL中の最終濃度。

表2： 細胞を用いた実験に使用したANPの用量。1アッセイ容量600μL中の最終濃度。

1. KRGB バッファー。シグマ社では、製品情報シートにこのバッ ファーの詳しい調製方法を記載しています。
2. 800 mM IBMX。100 mg の IBMX を 563 µL の DMSO に溶かす。20℃で保存します。IBMXはcGMP-ホスホジエステラーゼによるcGMPの分解を阻害します。
3. 刺激前バッファー。800mMのIBMX 9.4μLをKRGBバッファー10mLに加える。IMBXが完全に溶解するように激しくボルテックスする。この緩衝液は実験当日に新しく調製します。
4. cGMP キャリブレーター。凍結乾燥キャリブレーター 1 バイアルを PBS 5 mL に溶解します。この結果、cGMPキャリブレーター濃度は30µMとなります。内容物がすべて溶解するようによく混ぜます。氷上または4℃で保管してください。表1に示すように、cGMPアッセイバッファーでさらに希釈します。
5. 60 µM ANP。100 µg ANP を 0.1% BSA 添加滅菌 PBS 541 µL に溶解します。分注し、-20℃で保存します。表 2 に示すように、0.1% BSA を含む PBS でさらに希釈します。
6. 再構成ウサギ抗cGMP抗体およびHRP-cGMPコンジュゲート。cGMPアッセイバッファーを10mLずつ2つのバイアルに加え、よく混ぜて内容物を溶かし、氷上または4℃で2週間まで保存します。
7. ストップライトレッド基質溶液。この溶液は使用前に新しく調製し、調製後1時間以内に加えます。100XストックStoplight Red基質150 µLを基質バッファー15 mLに希釈し、3%過酸化水素17 µLを加えます。溶液は遮光してください。

方法

cGMP キャリブレーターを用いた CatchPoint cGMP Fluorescent Assay Kit（モレキュラーデバイス、cat #R8074）の使用法の詳細は、キットに添付されている製品 添付文書に記載されています。

RFL-6細胞研究のための細胞調製

ステップ1 RFL-6細胞を1mL中7.5 x 104 cells/mLで12ウェル組織培養処理マイクロプレートのウェルに播種しました。細胞を5％CO₂中、37℃で一晩培養しました。

ステップ2 翌日、細胞を封じ込めたウェルを静かに吸引し、400μLの刺激前バッファーで10分間インキュベートしました。200μLのANPストック溶液またはPBS（表2参照）を細胞を封じ込めたウェルに加え、37℃で15分間インキュベートしました。

ステップ3 細胞を溶解するために、200μLのセル溶解バッファーを各ウェルに加え、プレートシェーカーを用いてマイクロプレートを室温で10分間撹拌しました。

ステップ4 マルチチャンネルピペッターを用いて、各ウェルから40µLずつ取り出し、96ウェルプレートの別々のウェルに移しました。12ウェルプレートの各ウェルは、96ウェルアッセイマイクロプレートの4重反復に使用しました。

COS-7細胞研究のための細胞調製

ステップ1 コントロールpcDNA3.1プラスミド（Invitrogen）またはpcDNA3.1にクローニングされたMsGC-β3コード配列で、COS-7細胞をトランスフェクトしました *8。

ステップ2 トランスフェクションの3日後、細胞を回収し、EDTAフリーのCompleteプロテアーゼ阻害剤を含むM-PER抽出試薬中でホモジニアス化しました。

ステップ3 COS-7細胞抽出物を、50mM MOPS-KOH（pH7.5）、60mM KCl、8mM NaCl、4mM MgCl2または4mM MnCl2、cGMPホスホジエステラーゼ阻害剤ジピリダモールとザプリナスト各10mM、および1mM GTPを封じ込めたバッファー中で30分間インキュベートしました。

ステップ4 反応を0.2M酢酸亜鉛で停止し、過剰のGTPを0.2M Na₂CO₃で沈殿させました。サンプルを遠心分離し、上清を CatchPoint Assay Buffer で希釈しました（1:40 希釈）。

ステップ 5 マルチチャンネルピペッターを用いて、各ウェルから 40 µL ずつ取り出し、96 ウエルプレートの別々のウエルに移し、各サンプルを重複してアッセイしました。サンプルはTK CatchPointアッセイを用い、比色分析アッセイも並行して実施しました *11。

CatchPoint cGMPアッセイ法の手順

ステップ 1 再構成したウサギ抗cGMP抗体40マイクロリットルを全てのウェルに添加しました。マイクロプレートをプレートシェーカーで 5 分間静かに撹拌し、適切にプレーティングします。

ステップ2 再構成したHRP-cGMPコンジュゲート40マイクロリットルをマイクロプレートの全ウェルに添加し、穏やかに混合しました。その後、プレートを室温で2時間インキュベートしました。

ステップ3 インキュベーションが完了したら、アッセイマイクロプレートを1回につき300μLの洗浄バッファーで4回洗浄しました。

ステップ4 100μLのStoplight Red基質溶液を各ウェルにできるだけ速やかに添加しました。マイクロプレートは蓋をして遮光しました。

ステップ 5 60 分後、CatchPoint cGMP 製品添付文書に記載されている設定で蛍光強度を測定しました。蛍光はAnalyst™ AD、FlexStation™ またはGemini XSシステムを用いて測定しました。

測定結果

アッセイ性能

サイクリックGMPキャリブレーター

最初にcGMPキャリブレーターを用いてアッセイ性能を調べました。cGMPキャリブレーターの各濃度は4重反復で行いました。3回以上の実験の代表的な結果を図1に示します。3種類の蛍光マイクロプレートリーダーをすべて使用して 得られたEC₅₀値の範囲は、1.7～2.8 nMでした。SB比の範囲は、ゼロキャリブレーター濃度と3333 nMキャリブレーター濃度を用いて計算しました。Analystで得られた値は300から340の間、Gemini XSで得られた値は420から430の間、FlexStationで得られた値は400から480の間でした。

Z´ factorは、キャリブレーター濃度ゼロとキャリブレーター濃度3333 nMの16反復を用いて決定しました。3つの蛍光マイクロプレートリーダーすべてで得られたZ´ factorの値の範囲は0.89から0.95の間でした。

ラット肺線維芽細胞株RFL-6を用いて、ペプチドホルモンANPによるGCの活性化を研究しました。図2に示すように、Gemini XSまたはAnalyst ADを用いた再現性実験から得られたEC₅₀値は11～19 nMでした。SB比はGemini XSで400から450、Analystで300から350、FlexStationで425から500の範囲でした。Z´ factorsは、使用したすべての機器で0.5から0.73の範囲でした。

比色分析法との比較

次に、CatchPoint cGMP Fluorescent Assay Kitと他の市販の cGMP アッセイとの比較を行いました。CatchPoint アッセイを用いたキャリブレーター曲線の結果を、American Qualex社（カリフォルニア州サンクレメンテ）の試薬を用いた比色分析法と比較しました *11。比色分析法では、一次抗体、HRP-cGMPコンジュゲート（コンピテント）、cGMP含有サンプルを一晩インキュベートする必要があります。一方、CatchPointキットは2時間のインキュベーションで済みます。この2つのアッセイ法は、最適なインキュベーション時間で使用した場合、同じEC₅₀値（ \～250 fmol）を示します（図3参照）。

しかし、比色分析で2時間のインキュベーション時間を用いると、EC₅₀値は著しく低下しました（表3参照）。さらに、CatchPointアッセイのシグナル対ノイズ比は比色分析アッセイの22倍でした。

表3：比色分析（American Qualex）と蛍光（モレキュラーデバイス）のcGMPアッセイの比較。SN比は、3.7 nMキャリブレーターをシグナル、3333 nMキャリブレーターをノイズとして計算しました。

新規GC酵素を過剰発現したCOS-7細胞におけるサイクリックGMPレベル

サル腎臓細胞株COS-7を用いて、MsGC-β3と名付けられた新規GCの活性を研究しました。このGCは、NOに影響されない高い基礎活性を持ちます。MsGC-β3をCOS-7細胞に一過性にトランスフェクトし、72時間後、この酵素の2つの異なるトランスフェクタント、Mg²⁺とMn²⁺の存在下で、細胞のGC活性をアッセイしました。グアニル酸シクラーゼは、MnとMgの存在下で異なるレベルの活性を示すことが示されています *13。特異性では、他のあるNO非感受性GCは、Mg²⁺よりもMn²⁺の存在下で高い活性レベルを示しました(13)。その結果を図4に示します。

結論

本報告では、精製cGMP（キャリブレーター）およびcGMPを封じ込めた細胞溶解液を使用した場合、CatchPoint cGMPアッセイが高いSB比（直接比較で22:1）およびZ factor値を示す高感度アッセイであることを示しました。cGMPの測定には、2つの異なる細胞系を使用しました。まず、ペプチドホルモン誘導性cGMPレベルを測定し、次にユニークGCを一過性にトランスフェクトした細胞から産生されるcGMPレベルを測定しました。どちらのシステムでも、アッセイは信頼性が高く、高感度であることが実証されました。

CatchPointアッセイと比色分析アッセイを比較したところ、それぞれが最適な条件で使用された場合、2つのアッセイは非常によく似た結果を示しました。しかし、CatchPointアッセイの処理時間は3時間であったのに対し、比色分析では18時間を要しました。さらに、比色分析法には必須の終了ステップ（酢酸の添加）があり、シグナルは長時間安定しません。また、一定時間内に反応を終了させないと、コントロールを含むすべてのサンプルが飽和してしまい、値が無意味になってしまいます。対照的に、CatchPointアッセイで使用されるStoplight Red基質から生成されるシグナルは、24時間まで安定します。注目すべきは、一晩のインキュベーションではなく、2時間のインキュベーションで比色分析を比較した場合、キャリブレーターのEC₅₀値は4倍以上増加したことです。これら2つの特徴、ワンステッププロセス不要と処理時間短縮は、ハイスループット研究室が必要とする利便性を提供します。

参考文献

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