Application Note 中枢神経系創薬における
幹細胞由来ヒトニューロン

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はじめに

By L. Jackson, C. Verastegui, C. Wells, D. Pau, A. Nunn, A. Finucane, M. Lynch, S. Boldt, L. Gerrard, and S. J. MacKenzie, Scottish Biomedical, West of Scotland Science Park, Glasgow, Scotland, UK

中枢神経系（CNS）疾患は世界中の多くの人々に影響を及ぼしています。アルツハイマー病、統合失調症、不安神経症などの中枢神経系疾患の治療薬の質と数を増やすためには、中枢神経系創薬プログラムの成功率を向上させる必要があります。創薬における課題は、さらなる開発のためのリード化合物を同定するために、より適切なアッセイ系を開発することです。現在、中枢神経系の創薬・開発に用いられている細胞ベース・スクリーニングのアッセイ系には、初代細胞や市販の細胞株が用いられていますが、いずれも多くの欠点があります。

材料と方法

差別化プロセス

  • 未分化幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（hESC）のコロニーを機械的に継代して、BD BiosciencesのMatrigel™基底膜マトリックスコートIVFディッシュに播種しました。細胞はGerrardら, 2005に従ってヒト神経細胞に分化させました。

免疫細胞化学

  • 細胞を固定し、Gerrard et al, 2005の記述に従って免疫細胞化学を行いました。一次抗体はマウス抗Oct4（C-10; Santa Cruz）とウサギ抗Pax6（Chemicon）を用いました。二次抗体はヤギ抗マウスIgG Alexa Fluor 488およびヤギ抗ウサギIgG Alexa Fluor 555（Life Technologies, Inc.） 画像はZeiss Axiovert 100M共焦点顕微鏡を用い、63倍のオイルレンズで撮影しました。

ウェスタンブロット分析

  • 細胞溶解液を調製し、約30μgの全タンパク質をNuPage® Novex 4-12% BisTrisゲル（Life Technologies, Inc.）で分離しました。ニトロセルロースに移した後、ウサギ抗GAD65/67抗体（Chemicon）を用いて膜をプローブしました。ヤギ抗ウサギHPRT二次抗体（Sigma）を適用し、ECL検出基質（Pierce）を用いてシグナルを検出しました。

電気生理学

  • （mM）を封じ込めた生理的細胞外液を用い、室温で全細胞パッチクランプ法を用いてイオン電流と活動電位を記録しました： NaCl（140）、KCl（20）、CaCl2（2）、MgCl2（1）、グルコース（10）、HEPES（10）、pH7.4。細胞内ピペット溶液は(mM)を封じ込めました： KCl（30）、HEPES（5）、MgCl2（1）、K-アスパラギン酸（110）、Na2 ATP（4）、NaGTP（0.4）、EGTA（0.015）、pH 7.3。電流の電圧依存性は、-90 mVの保持電位から、あるいは-40 mVでナトリウム電流を不活性化した状態から、1 Hzで100 msの持続時間のパルスを5 mVのステップで増加させながら、+80 mVまで測定しました。薬物（GABAなど）の時間依存的効果は、プロトコール中、保持電位を-90mVで一定に保つことで測定しました。電流クランプ実験では、安定した再生活動電位が生じるまで電流パルスの列を徐々に増加させながら繰り返し刺激することで、各細胞に活動電位が誘発されました。

GPCR薬剤スクリーニングアッセイ開発

  • G タンパク質共役型受容体（GPCR）活性化に対する反応は、FLIPR® Calcium 4 Assayの色素を用いてFlexStation® 3 マルチモードマイクロプレートリーダーで測定しました。96ウェルフォーマットでは、細胞をポリ-D-リジン プレコート黒底96ウェルBioCoatプレート（BD Biosciences）に播種し、アッセイ24時間前に100 μLの増殖培地で培養しました。5mMプロベネシドと0.1%BSAを封入したFLIPR Calcium 4 Assayの色素100μLを各ウェルに添加し、プレートを37℃で1時間インキュベートしました。FlexStation プレートリーダーの "Flex "読み取りモードと統合型ピペッターを用い、10 μM LPA（50 μL）アゴニストをテストプレートに添加し、励起を485 nm、発光を525 nmで蛍光を測定しました。

結果

hESC由来ニューロンの生成

未分化のhESCを、NogginとbFGFを封入した神経細胞誘導培地に播種しました。細胞は約3週間培養維持され、その後細胞は神経細胞系譜に分化し始めました。これは、神経前駆細胞（NP）に関連するマーカーであるpax6とネスチンの誘導から明らかです（図1）。さらなる神経細胞の成熟は、bFGFの除去と低細胞密度での播種によって達成されました。神経細胞は、MAP-2、β-チューブリンIII、PSA-NCAMの発現によって同定されました。これらの神経細胞は、GABA作動性の表現型を示すGad 65/67を発現していることも示されました（図2）。(図2）これらの神経細胞は、FlexStation® 3マイクロプレートリーダーで分析するために96ウェルプレートに、あるいは電気生理学的に分析するために10mmカバースリップに播種されました。

電気生理学

全細胞パッチクランプ記録は、神経前駆細胞と成熟ニューロンから行いました。どちらのタイプの細胞も、カリウム外向き電流の存在を示しました。しかし、成熟神経細胞だけが、100 nMのテトロドトキシン（TTX）に感受性のある内向きナトリウム電流を示しました（図3A参照）。(内向き電流は一般に外向き電流と共存し、両電流とも典型的な電圧依存性を示しました（図3B参照）。(成熟したニューロンは、グルタミン酸（100 μM）とGABA（1 mM）の印加に反応して典型的な全細胞電流を発生し（図4A）、自発発火活動を示しました（図4B）。(図4B）神経前駆細胞ではこのような活動は観察されなかったです。電流クランプ下で、細胞を刺激して活動電位を誘発しました。ほとんどの成熟ニューロンはオーバーシュート活動電位を発火させることができ（図5A）、この細胞群にナトリウムチャネルが存在することと一致しました。しかし、ニューロプロジェニター幹細胞では、活動電位の発生も記録もできなかったです（図5B）。(図5B）

GPCRカルシウムアッセイ

本研究では、天然の内因性システムにおいて候補ターゲットをスクリーニングするために使用できるカルシウム動員アッセイを示します。その結果、FLIPR Calcium 4 Assayで質の高いデータとアッセイ性能が得られること、また他の類似のアッセイシステムに匹敵することが示されました。本研究では、GPCR標的を過剰発現しているHEK細胞株と、同じ標的を内因的に発現しているニューロン（上記のように作製）に対して選択的アンタゴニストを用いて、このアッセイを検証しました。(図6と7）過剰発現安定細胞株も、GPCR標的を内因性に発現している神経細胞も、同様の阻害剤プロファイルと選択性を示しました。このことは、神経細胞株が自然環境におけるGPCR標的のプロファイリングに適したモデルであることを示しています。

ディスカッション

私達は、中枢神経系の創薬に大きな影響を与え、それを改善するヒト・ニューロンの再現性のあるバッチを作製しました。幹細胞由来のニューロンは、成熟ニューロンに典型的に関連する既知のマーカーをすべて発現し、機能的に活性です。それらは典型的なナトリウム（TTX感受性）とカリウム電流を発現し、飽和濃度の神経伝達物質GABAとグルタミン酸に反応します。さらに、これらの細胞にはオーバーシュート活動電位を発火させる能力があります。

私たちはスクリーニング目的でニューロンをフォーマットすることができ、刺激によるカルシウムと膜電位応答を測定することができます。ニューロン内で内因性に発現するトランスポーターやレセプターの発現プロファイルを確認し、目的のタンパク質を過剰発現させるように操作することができます。これによって、中枢神経系に関連する複数のターゲットに基づく、優れたスクリーニング・システムをさらに強化することができます。

私達は最近、統合失調症に関与する新規GPCR標的のアンタゴニストを同定するスクリーニングに、このニューロンを使用しました。ニューロンはこのGPCRを高レベルで発現していることが示され、比較研究のためにこのGPCRを過剰発現する安定な細胞株を作製しました。カルシウム反応を測定することにより、フォーカス・ライブラリー・スクリーニングからヒット化合物を同定しました。その結果、神経細胞は安定細胞株よりもデータ量が多く、プロジェクトの成功に必要なデータであることが証明されました。

参考文献

  1. Gerrard, L., Rodgers, L. and Cui, W. (2005). Differentiation of human embryonic stem cells into neural lineages in adherent culture by blocking BMP signalling. Stem Cells, 23: 1234–41.

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