Application Note ImageXpress Nanoシステムで
DNA損傷評価を効率化

  • 核マーカーのイムノアッセイを用いて固定細胞を画像化
  • DNA二本鎖切断の発生率を正確に測定
  • オンザフライ分析で結果を即座に反映
  • マイクロプレートのヒートマップで陽性ウェルを簡単に検出
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はじめに

Jayne Hesley｜アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラーデバイス

DNAや染色体の損傷を評価することは、遺伝子の突然変異、癌、老化を含む様々な疾患において重要な意味を持つため、研究への応用が頻繁に行われています。DNAの損傷は、自然に起こることもあれば、電離放射線、環境の影響や汚染物質、化学物質への曝露によって生じることもあります。これまでの研究で、ヒストンH2AXのセリン139上でのリン酸化は、DNA二本鎖切断の早期かつ鋭敏な指標であることが示されています *1。

本研究では、リン酸化ヒストンH2AXの免疫蛍光検出に基づき、選択された低分子のDNA損傷効果を特徴付けるための自動細胞イメージングアッセイの開発について詳述します。具体的には、化学療法剤であるMitomycin C（MMC）とエトポシドによる処理に反応して、CHO、HeLa、PC12細胞（すべてのデータが示されていません）の核DNA損傷を定量することが可能となりました。

リン酸化H2AXの細胞免疫蛍光アッセイはDNA損傷を定量化

細胞DNA損傷は、市販の試薬を用いてImageXpress® Nano 自動イメージングシステムで可視化・定量化できます。リン酸化H2AX（EMD Millipore）に対する一次抗体とAlexaFluor標識抗二次抗体（Life Technologies）をペアにして細胞免疫蛍光アッセイをデザインしました。核はHoechst 33342で対染色し、10倍の対物レンズと標準的なDAPIおよびFITCフィルターセットを用いてImageXpress Nanoシステムで画像を取得しました（図1）。

図1. DNA損傷IFアッセイ。

  • 384ウェルクリアボトムポリスチレンマイクロプレートに5000～7500細胞/ウェルで細胞を播種します。
  • 37°C/5%CO2で一晩培養します。
  • DNA損傷化合物の1:2連続希釈液で細胞を18～24時間処理します。
  • 4%ホルムアルデヒドで室温で20分間固定します。
  • PBSで細胞を洗浄した後、1% BSA+ 0.1% Triton X-100で細胞をブロックし、室温で30分間透過処理します。
  • 抗H2AX一次抗体を添加し、4℃で一晩インキュベートします。
    1x PBSで3回洗浄します
  • 蛍光標識二次抗体＋16 µM Hoechstを添加し、室温で1～2時間インキュベートします。
  • 細胞を1x PBSで3回洗浄します。
  • ImageXpress Nano システムで 10X Plan Fluor 対物レンズで画像を取得し、その場で Cell Scoring 解析を行います。

その場での細胞スコアリング解析により、損傷したDNAを持つ核を効率的に特定できる

CellReporterXpress™  画像取得・解析ソフトウェアには、DNA損傷を示す細胞のパーセンテージを計算するだけでなく、DNA損傷マーカーの陽性または陰性として核を分類するように簡単に設定できる、設定済みのCell Scoringアプリケーションモジュールが含まれています。取得ルーチンと解析ルーチンが連動しているため、プレート読み取り終了後、画像と数値データの両方を迅速に確認することができます。さらに、撮影視野が広いため、10倍の対物レンズで単一部位を撮影するだけで、正確な濃度反応曲線を算出することができます（図2）。特に、この倍率で単一視野を撮像すると、試験した最高濃度では500個を超える細胞、亜毒性濃度のマイトマイシンC（MMC）で処理したウェルでは2800個を超える細胞が撮像されました。

図2 （A）核を10倍の倍率で画像化し、二本鎖切断マーカーphospho-H2AXについて陽性または陰性としてスコアリングしました。この分割図は、左側に蛍光染色した核（赤）とDNA損傷マーカー陽性の核（黄／緑）、右側にすべての核を灰色で、陽性の核を黄色でマークした細胞スコアリングマスクを示します。(B）化学療法化合物で24時間処理した後のCHO細胞におけるDNA損傷反応です。phospho-H2AX陽性細胞の割合をMMCとエトポシドの濃度に対してプロットすることにより、化合物の用量反応を計算しました。

結論

ヒストンH2AXのリン酸化は、哺乳類細胞における二本鎖DNA切断の鋭敏な指標です。ここでは、マルチウェル・マイクロプレートを用いた免疫蛍光細胞ベースのアッセイにより、CHO細胞におけるDNA損傷の定量を容易に自動化するCellReporterXpressソフトウェアとImageXpress Nanoシステムの有用性を示します。この細胞イメージングシステムの統合された画像取得、オンザフライ解析、即時データ可視化機能（図3）により、DNA損傷に対する濃度反応効果を客観的に評価することが可能となり、手作業による顕微鏡法に比べてデータの質とスループットが向上しました。

図3. (A) MMCまたはエトポシド処理に対するDNA損傷反応は、マイクロプレート全体のH2AX陽性核のパーセントを統合したヒートマップで可視化することにより、迅速に評価できます。この図では、2セットの4重複製で、最も高い化合物処理が最上段にあります。H2AX陽性核の割合が高いウェルは赤色、低いウェルは緑色で示されています。(B) データは、X軸にエトポシドの濃度、Y軸に陽性細胞の割合をとった散布図でも可視化できます。

参考文献

  1. Paull T.T., Rogakou E.P., Yamazaki V., Kirchgessner C.U., Gellert M., Bonner W.M..2000. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Curr Biol. 10, 886-95.
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