Application Note 総タンパク質およびリン酸化タンパク質の検出

p38 MAPK活性化

はじめに

p38 MAPKは、セリン/スレオニンプロテインキナーゼのマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）ファミリーのメンバーである。これらのタンパク質は真核生物間で広く保存されており、細胞増殖、細胞運動、細胞死など多くの細胞プロセスに関与している。p38 MAPKは、成長ホルモン、Gタンパク質共役型受容体のリガンド、炎症性サイトカイン、浸透圧ショックやヒートショックなどのストレスを含む様々な刺激に応答して活性化される。MAPKは、標的タンパク質基材の特異性セリン・スレオニンをリン酸化し、外部からの刺激を細胞表面から翻訳機構、細胞骨格タンパク質、転写因子などの細胞内標的へと伝えるシグナル伝達カスケードで機能する。p38 MAPKシグナル伝達カスケードは、成長因子、細胞ストレス（浸透圧ショック、放射線など）、炎症性サイトカインなどの外部刺激が細胞表面レセプターに認識されると開始される。その結果、RHOファミリーGTPase（Rac、Rho、Cdc42）が活性化され、MAPKKK（MLK、TAK、ASK1など）が活性化される。これらのMAPKKKは次にp38 MAPKキナーゼをリン酸化して活性化し、p38 MAPKキナーゼは次にp38 MAPKをリン酸化する。リン酸化された（活性化された）p38 MAPKの標的には、転写因子STAT1、Myc/Max8、Elk-1、CHOP9、MEF2、ATF-24、および（Msk-1を通して）CREBが含まれる。p38 MAPKの光学収差は、喘息や自己免疫などのヒトの疾患を含む、様々な生理的病態に関与していると考えられている。

アッセイ手順

Active Motif社（カリフォルニア州カールスバッド）が提供するFACEアッセイ（Fast Activation Cell ELISA、Cat# 48600）を、HRP標識体をFITC標識二次抗体に置き換えて蛍光読み出し用にアレンジした。アッセイの様子を図1に示す。

プロトコール

1. 接着細胞を96ウェルプレートでは5000個/ウェル、384ウェルプレートでは1500個/ウェルになるように播種する。
2. 4時間培養して接着させ、一晩血清飢餓状態にする。
3. アニソマイシンでセルを15分間刺激し、4％ホルムアルデヒドで20分間固定する。
4. 細胞を0.2% Triton X-100で10分間浸透させる。
5. PBS中5％BSAで30分間ブロックする。
6. 一次抗体を加え、密封し、4℃で一晩インキュベートする。
7. PBSで3回洗浄する。
8. FITC標識二次抗体を5% BSAで添加し、1時間インキュベートする。
9. PBSで3回洗浄する。
10. エチジウムホモダイマー-1核染色を加える。
11. ImageXpress Velosでスキャンする。

結果と考察

ImageXpress®Velosシステムは488 nmのレーザーで設定された。二次抗体（緑色）蛍光の発光は、チャンネル1（Ch1）用の510～540 nmのバンドパスフィルターでフィルタリングされ、EthD-1（赤色）はチャンネル3（Ch3）用の600 nmのロングパスフィルターでフィルタリングされた。プレート全面を5ミクロンの解像度でスキャンし（4分/プレート）、得られたデータをBlueImageソフトウェアパッケージで処理した。完全なウェルを個々のセルについて分析した。図2には、刺激後のリン酸化型p38の存在量が、p38の総量と比較して増加していることを示す、フォームウェルからの細胞のイメージングを示した。これらの結果は、キナーゼによって媒介される細胞シグナリングイベントを検出するためのリン酸化特異性抗体の使用を実証している。核カウンター染色を用いて、各ウェル中のセル数をカウントした。

Ch1 シグナルを各ウェルについて積分し、細胞数で正規化した。細胞計数用EthD-1核染色後の細胞のイメージングを図3に示す。核の明確な分離が認められ、この手法によるロバスト性の細胞計数が可能である。

図4に示したこれらの結果の要約は、単一細胞レベルでのMAPキナーゼ活性化の検出を示している。このリン酸化を単一セルで測定できることは、データの質を大きく向上させる。このアッセイは、リン酸化特異性抗体が利用可能なタンパク質であれば、どのようなタンパク質にも適用可能である。将来、このタイプのアッセイでは、同一ウェル内でより高いマルチプレックス性を得るために、マルチカラーを使用する予定である。

結論

ImageXpress VelosシステムスキャニングプラットフォームとBlueImage細胞解析ソフトウェアの使用により、Active Motif Fast Activation Cell ELISAアッセイキットを用いた全タンパク質およびリン酸化タンパク質の検出研究が実証された。その結果、MAPキナーゼ活性化を単一細胞レベルで検出し、細胞数で正規化することで、データの質が大幅に向上することが示された。今後のマルチプレックスアッセイでは、総タンパク質や他のリン酸化種と同じウェルでリン酸化タンパク質の検出をマルチプレックスする予定である。ヨウ化プロピジウムを用いた細胞周期分析も可能であり、細胞周期の状態によって定義される亜集団内の反応を見るために用いることができる。一般に、ウェル全体をベースとした個々の接着細胞のイムノフェノタイピングは、探索プロセスにおいて強力な技術である。ImageXpress Velosシステムは、蛍光ベースのELISAアッセイをより使いやすく定量する必要があるラボにとって、魅力的なソリューションです。このプラットフォームのユニークな光学系とスキャニングエンジンは、アカデミックおよびバイオテクノロジーのスクリーニングの両方のニーズを満たすシンプルな「プラグアンドプレイ」アプリケーションを可能にします。