Application Note モノクロナリティ評価に最適な
ClonePixシステムの活用方法
PDF版（英語）
Omee Ahmed, Julian Burke, Christopher Mann, Sky Jiang, Kerensa Klottrup , Natalie Smithers、モレキュラーデバイス チュートリアル：2009年11月1日（Vol.29, No.19）
確立されたシステムによる哺乳類細胞株のスクリーニングと選択の簡素化
希釈法、リングクローニング、またはコロニーの単純な手動採取による候補哺乳類細胞クローンの分離は、時間とリソースを大量に消費し、コストも高く、さらに細胞のクロスコンタミネーションやユーザーエラーが発生しやすい手法です。一般的に遭遇する大きな欠点の1つは、モノクロナリティの確立が困難であることです。これは、治療用タンパク質や抗体の生産において不可欠なステップです。
多くの欠点を克服するために、Genetix社は分泌細胞株のスクリーニングと選択を目的としたClonePix™システムを開発しました。ClonePixシステムの有用性は、数千のクローンから分泌されるタンパク質をin situで可視化・定量し、最も価値の高い分泌クローンのみを正確に選択・分離できる点にあります。これにより、タイムスケールを短縮し、後工程の培養を簡素化します。
ClonePixシステムは、分泌抗体やモノマー型タンパク質、細胞表面タンパク質、内在性GFP融合タンパク質の特異的検出において検証されています。ハイブリドーマ、ミエローマ、HEK293、懸濁適応型および接着型CHO細胞など、幅広い細胞タイプに対応しています。
ワークフロー
ワークフローの基本的な最初のステップ（図1）は、哺乳類細胞株を半固体培地で培養し、各コロニーが単一の親細胞から形成されるようにすることです。数千の細胞からなる不均一な集団は、1ウェルまたは6ウェルのマイクロプレートでクローンコロニーに成長します。その後、白色光でコロニーを検出し、蛍光で分泌タンパク質をin situで定量することにより、迅速にスクリーニングします。
分泌タンパク質検出アッセイでは、蛍光検出プローブを用いてコロニー周囲に分泌産物を固定化する必要があります。専用のClonePixシステムソフトウェアは、各コロニーに関連する蛍光を定量し、最も望ましいクローンのみを96ウェルの目的プレートに自動ピッキングします。図2は、最高産生クローンを識別する例の画像を示しています。異なる蛍光色素で標識された検出試薬を使用することで、複数のタンパク質を同時に検出・分離することが可能です（マルチプレキシング）。
ハイブリドーマ融合の場合、抗原を検出プローブとして追加することで、抗原特異性に基づいてクローンを選択できます。これは蛍光で直接コンジュゲートするか、二次検出試薬を介して行います。ピッキングされたコロニーのプレートは、クローンの拡大とスケールアップの準備としてコンフルエンスまで培養されます。
モノクローナリティの評価：統計
半固体培地から採取されたハイブリドーマのクローン性は以前に評価され、適切な播種密度では偶然一致（非クローン性）の確率が4％であると結論付けられました。Genetix社は、モノクロナリティの確率と播種密度／コロニーサイズの相関を示す統計計算も生成しています。
典型的な実験では、CHO細胞を半固体培地に播種し、直径35 mmのウェル（6ウェルマイクロプレート）で25個のコロニーアウトグロースを生成します。14日目には、コロニーの直径は約0.75 mmです。次の式を使用します：
$$\frac{0.25 \times \pi \times (0.75+0.75)^2 \times (n-1)}{0.25 \times \pi \times 35^2}$$
ここで、コロニー数 n=25 の場合、偶然一致の確率は4.4％となり、1回のクローニングでモノクロナリティの確率は95.6％であると推定されます。これは以前に決定された値と非常に近いものです。
モノクローナリティの評価：実験
統計理論を実験的に検証するため、IgGを分泌する2種類のハイブリドーマ細胞株（IgG₁とIgG₂a）を組み合わせました。コロニーはCloneMatrixベースの半固体培地で培養し、IgG₁およびIgG₂aに対するアイソタイプ特異的抗体を蛍光標識して添加しました。AlexaFluor 488結合抗IgG₁はClonePixシステムのFITCチャンネルで、AlexaFluor 546結合抗IgG₂aはローダミンチャンネルで可視化しました。代表的な画像は図3に示します。
コロニーはClonePixシステムソフトウェアで解析され、FITCの外側平均強度が高くローダミン強度が低いもの（IgG₁分泌クローン）、またはFITCが低くローダミンが高いもの（IgG₂a分泌クローン）に基づいてピッキングされました。
合計312コロニー（各タイプ156個）がピッキングされ、96ウェルプレートで4日間培養されました。その後、調製培地を用いてIgG₁およびIgG₂aをアイソタイプ特異的ELISAアッセイ（Bethyl Laboratories）で評価しました。
アウトグロースが不十分な細胞や両方のIgGに対してELISA陰性の細胞は除外しました。結果として、IgG₁特異的蛍光に基づいてピッキングされた143コロニーのうち、IgG₂aを低レベルで示したものは1つのみでした（クローン性＝99.3％）。IgG₂a特異的蛍光に基づいてピッキングされた81コロニーのうち、3つが不均一でした（クローン性＝96.4％）。全データセットのモノクロナリティは98.25％と計算されました。
この実験データは、ClonePixシステムで1回のピッキング後のクローン性が95.6％以上であるという統計評価を裏付けています。さらに、同じ式を用いて、より早い時点（コロニー直径が0.35 mmのとき）でピッキングすることで、モノクロナリティの確率が99.0％に増加することが計算されます。加えて、2回目のクローニング（ピッキングしたクローンを再播種して再ピッキング）を行うことで、モノクロナリティの確率は99.9％に達します。
概要
ClonePixシステムは、治療用タンパク質や研究用モノクローナル抗体の生産に一般的に使用される分泌哺乳類細胞株の迅速なスクリーニングと分離において、強力なツールであることが実証されています。このシステムは全体的な生産性を向上させ、抗体の特性評価や新しいプロジェクトの開始により多くの時間を割けるようにします。本チュートリアルで提示したデータは、半固体培地から哺乳類細胞のコロニーをピッキングすることが、クローン細胞株を分離する効果的な手段であることを支持しています。
Omee Ahmed is student lab technician, Julian F. Burke, Ph.D., is CSO at Genetix, Christopher J. Mann, Ph.D. (chris.mann@ genetix.com), is senior application support specialist, Sky Jiang is research manager, Kerensa J. Klottrup, Ph.D., is senior scientist, and Natalie Smithers, Ph.D., is a postdoctoral scientist. Web: www.moleculardevices.com/genetix.
PDF版（英語）