Application Note Genetix ClonePix FLを用いた
ハイブリドーマのスクリーニング

方法と結果

半固形培地でのセル樹立（安定ハイブリドーマ株を使用）

目的：細胞を半固形培地にアダプターし、ClonePix FLスクリーニングのためのプレーティング条件を確立する。安定したハイブリドーマ株で最初に条件を確立することをお勧めします。この方が、新鮮な融合細胞から始めるよりも最適化に要する時間が短くて済むからです。この段階では、数回のプレーティングを想定してください。

* プレーティングとミキシングに関する特異性プロトコールについては、「ハイブリドーマ入門」をご参照ください。

1. 凍結細胞を使用する場合は、生存率が少なくとも85％、望ましくは90％以上になるまで、約48時間解凍し継代する。
2. プレーティング当日、スピンして細胞を2mLに濃縮する。生細胞数を測定する。
3. 様々な密度の細胞を培地にプレーティングする練習をする。コロニーセレクションとピッキングを成功させるためには、播種密度を最適化することが重要です。3種類の密度でプレーティングする： 50細胞/mL、100細胞/mL、150細胞/mL。 8a1b6719399805e6473c4be177893ab4
4. 蛍光検出試薬CloneDetectも同時に培地に加える。これにより、最終濃度（100 mL中1 mL）に最小量が追加される。
5. 固形培地を入れたプレートを、37℃、5％ CO 2 の条件下で、少なくとも4日間インキュベートする。
6. 適切な時点（通常10日間）で、増殖しているコロニーの存在を光学顕微鏡で確認する。ウェルあたりのおおよそのコロニー数を測定する。理想的なプレーティングは、コロニー数(100個/ウェル)が得られるこ とである。
7. 増殖が見られない場合は、補充が必要かもしれない。安定した株を得るには、まず以下のものを試してみることを推奨する： 8dfd9fcb94ea433ce077147999337e06

新鮮融合を用いたハイブリドーマスクリーニングの確立

目的：新鮮な融合を用いて半固形培地での条件を最適化する。新鮮なハイブリドーマ融合をプレーティングする場合、最適な播種密度は融合の効率だけでなく、選択のカイネティックや効率にも大きく依存する。半固形培地に播種する前に、セルは一定期間回復する必要があるかもしれません。ハイブリッドの選択を成功させるためには、適用する選択圧（すなわちHATの濃度）の最適化も必要であろう。

1. 半固形培地にプレーティングする前に、融合を液体選択「HAT培地」中で24～48時間休ませる。
2. 樹立したハイブリドーマ用に最適化した同じ培地を使用し、最終容量100mLになるようにプレーティングする。1X HAT、優先抗生物質、L-グルタミン（最終濃度8mM）を添加する。(より安定な類似品であるInvitrogen社のGlutaMaxを推奨する）。
3. プレーティングの当日、スピンして細胞を2mLに濃縮する。総生細胞数を測定する。
4. 細胞を4種類の密度でプレーティングする： 5000, 1X104, 1X105, 1X106 cells/mL。
5. プレートを37℃、5% CO 2 の条件下で少なくとも7日間インキュベートする。