アルツハイマー病におけるミクログリアの役割の
研究にFLIPR Pentaシステムを使用
企業／大学
カーディフ大学認知症研究所
チームメンバー
エミリー・マグワイア博士、ニーナ・シュテーベル博士、ヘイゼル・ホール＝ロバーツ博士、ベサニー・ショー博士、レイチェル・オドナヒュー女史、ジンシー・ウィンストン
使用製品
FLIPR Pentaハイスループットセルベーススクリーニングシステム
FLIPRカルシウムアッセイキット
課題
カーディフ大学UK認知症研究所のエミリー・マグワイア博士と彼女のチームは、アルツハイマー病の原因を特定し、患者のケア、診断、ひいては治療を改善することを目指している。
エミリーのグループの研究は、アルツハイマー病の患者とそうでない人の脳細胞で何が違うのかを特定することに焦点を当てている。特異性については、ミクログリアと呼ばれる脳免疫細胞の一群がアルツハイマー病の進行に重要な役割を果たしていることを調べている。アルツハイマー病のリスクを推定するために遺伝子検査を行い、低リスク者とすでにアルツハイマー病に罹患している高リスク者の2つのグループから血液サンプルを採取する。血液細胞を幹細胞に形質転換し、ミクログリアに分化させる。この方法によって、研究チームは高リスク者と低リスク者のミクログリアを比較し、アルツハイマー病に関連する違いを特定することができる。この研究により、科学者たちは将来、アルツハイマー病の特異性治療法を開発できるようになるだろう。
アルツハイマー病に罹患した細胞におけるカルシウム・シグナルの機能不全については、先行する科学的研究のかなりの部分が広く立証している。このため、健康なミクログリアと病気のミクログリアとのカルシウムシグナルの変化を比較することが重要であったとマグワイア博士は言う。Maguire博士は以前、倒立顕微鏡を用いて、認知症リスクのレベルが異なる細胞間のカルシウム・シグナル伝達を個々の細胞レベルで調べたことがある。この手法では貴重なデータが得られたが、複雑で時間がかかることが判明した。その結果、60の細胞株でカルシウム・シグナリングを研究するという課題に直面したとき、FLIPR Pentaは理想的な解決策を提供した。
「倒立顕微鏡でサンプル1個をFLIPR Pentaと同じ再現性で撮像するには、3時間（プラスカルシウム色素のローディングに1.5時間）を要しました。しかし、FLIPR Pentaを使えば、約30分のハンズオン時間（＋カルシウム色素ローディング）で、30倍のサンプルを画像化できます。これにより、リピート取得のプロセスが大幅に簡略化されます。」
- エミリー・マグワイア博士
解決策
研究チームは、FLIPR Pentaを利用して、既知のカルシウム調節剤に曝露したときのアルツハイマー病リスクの高い患者のミクログリアと低い患者のミクログリアの反応を比較した。これらの比較は、疾患細胞と非疾患細胞間のカルシウム・シグナリングの相違を同定することを目的とし、潜在的に病態の根底にあるものに光を当てるものである。
このアプローチでは、細胞を384ウェルプレートにプレーティングし、Molecular Devices社の緑色蛍光カルシウム6色素で染色した。インキュベーション後、特異性化合物（例えばATP）を別のプレートにロードした。両方のプレートをFLIPR Pentaにプレーティングし、化合物を細胞に添加し、添加前と添加後5分間の蛍光の変化を記録した。これにより研究チームは、化合物添加時に放出されたカルシウムを測定し、細胞シグナリングレベルを測定することができた。結果を標準化するため、研究チームは細胞プレートの画像も撮影し、各ウェルの細胞数に基づいて蛍光測定を正規化した。
「FLIPR Pentaのおかげで、実験間の外的要因の変動によるばらつきを最小限に抑えながら、384ウェルプレートで1実験あたり最大24サンプルという多数のサンプルをアッセイできるようになりました。さらに、FLIPRインストゥルメンテーションにより、各ウェルに同時に正確な量の試薬（特に我々の場合はATP）を投与することができるので、すべてのウェルで均一性が確保され、測定の一貫性が高まります。」
- エミリー・マグワイア博士
研究者がFLIPRカルシウムアッセイ用のプレートを準備するのに要する時間はおよそ2時間ですが、この時間の多くは色素のインキュベーションだけです。プレートの実際のイメージングには10分かかる。このため、カルシウム6のプレーティングをずらせば、1日に50枚以上のプレートをイメージングすることが可能である。
結果
この研究は決定的なものではありませんが、予備的な結果では、ATPを介したカルシウムシグナル伝達において、2つのグループ間で差がある可能性が示されました。
「FLIPR Penta法を用いて、より多くの患者由来のセル株を用いてさらなる実験を行うことで、本研究のロスト性を高め、より決定的な結果を得ることができる可能性があります」
- エミリー・マグワイア博士
有意な変異が観察されれば、ATP-カルシウムシグナル伝達がアルツハイマー病において重要な役割を果たしていることが示唆され、治療法開発の新たな道が開ける可能性がある。
A. このグラフは、アルツハイマー病リスクの高いミクログリアでは、低リスクのセルと比較して、ATP添加後にカルシウム放出が増加する傾向が有意ではないことを示している。このデータは、9つの幹細胞株（ハイリスク6株、ローリスク3株）からなる予備セットで収集された。異なる色は様々な個体の細胞を示し、異なる形は異なる実験複製を示す。
B. カルシウム6色素で染色したミクログリアの蛍光顕微鏡イメージ。
研究チームは、ATP以外にも、細胞内でカルシウム動員において重要な役割を果たすメディエーターをいくつか同定した。したがって、今後の研究では、さまざまな受容体に結合するADPやUDPのようなヌクレオチドなど、さまざまなメカニズムでカルシウム放出を誘導することが知られている異なる分子を導入した場合の効果を調べることができる。このような代替活性化物質に対するアルツハイマー病リスクの高いミクログリアと低いミクログリアの反応を比較することで、2つのグループの間に何らかの違いが存在するかどうかを評価することができる、というのが研究チームの考えである。
