CRISPRゲノム編集技術による疾患モデル研究の革新

研究者がCRISPR-Cas9遺伝子編集を用いてシングルセル内で遺伝子を正確に変化させることができるようになったという事実は、疾患モデリングの分野にまで波及しており、その進歩は間もなく治療薬にまで到達するかもしれません。実際、CRISPRはさまざまな疾患のメカニズムや薬剤スクリーニング、治療法の研究を加速させ、疾患モデリングに革命をもたらしていると言っても過言ではないでしょう。CRISPRは、突然変異に起因する疾患を研究する上で有用ですが、例えば分子シグナル伝達経路を解明する際に、目的の遺伝子を無効にしたり挿入したりするための強力なツールでもあります。疾患モデルはまた、治療薬候補の安全性と有効性に関する前臨床研究のための貴重なツールでもあります。ここでは、疾患モデルにおけるCRISPRツールの現在の応用例を見てみましょう。

ゲノム編集と創薬スクリーニングのためのツール

疾患モデルには、2D細胞培養、3D細胞培養（スフェロイドやオルガノイドなど）、臓器チップシステム、in vivo動物モデルなど様々な形式があります。しかし、CRISPRアプリケーションの初期段階は、ゲノム編集の検証、自動化、スクリーニングのためのツールによって促進されます。

モレキュラーデバイスは、CRISPR アプリケーションをサポートする幅広いツールを提供しています。「CloneSelect Imager（CSI）モノクロナリティ検証を目的とした高速イメージングを用いる場合でも、SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーでのウェスタンブロット解析、またはImageXpress HCS.ai ハイコンテントイメージングシステムでのハイコンテントイメージングによる下流の画像解析のいずれにおいても、科学者は編集を確認し、これらの変異が細胞の挙動、シグナル伝達経路、またはタンパク質発現をどのように変化させるかを追跡することができます」と、モレキュラーデバイスのシニアワークフローイノベーションおよびソリューションスペシャリストであるRebecca Kreipke は述べています。CSIはトランスフェクション効率を評価し、細胞のコンフルエンスをモニターし、蛍光スクリーニングを行うことができます。CRISPR編集が正常に行われたことを確認できるため、研究者は自信を持って研究を進めることができます。「研究者は、細胞治療や遺伝子治療、あるいは生物製剤モデルの開発において、どの細胞株で研究を進めるべきかについて、より迅速にデータに基づいた決定を下すことができます。

治療薬の化合物を大規模にテストするのは骨の折れる作業ですが、ラボでは自動化が進んでいます。ハイスループット・プラットフォームでの薬剤スクリーニングは、薬剤候補を迅速に処理し、臨床試験に進む有望な数種類を見つけることができます。"私達のCellXpress.ai自動細胞培養システムは、細胞培養と薬剤スクリーニングのワークフロー全体の自動化を可能にします。「CellXpress.aiシステムは、再現性のある、アッセイ準備の整ったプレートをご提供することで、実験に次ぐ実験に、十分に特性化された細胞株をご提供します。」CellXpress.aiシステムは、貴重な科学者たちを、手間のかかる手作業による細胞培養の負担から解放し、また、実験ごとにスクリーニングの開始材料が一貫していることを保証することで、データの質を向上させます。このシステムはまた、毒性、オフターゲット効果、治療効果を研究するために、薬剤に対する細胞の反応を自動化し、リアルタイムでモニタリングすることもできます。

精密細胞株

EditCo Bio社は、CRISPR-Cas9を使用して、遺伝性疾患、神経変性疾患、がんのモデルを構築するために使用される細胞株において、正確な遺伝子改変を行います。「例えば、私達は、KRAS-G12DやKRAS-G12Cのような臨床的に関連性のあるKRAS変異をヒト膵管上皮細胞や肺上皮細胞に導入するためにCRISPRを使用してきました。「これらのアイソジェニックモデルにより、研究者はKRASによる腫瘍形成の研究、下流のシグナル伝達経路の評価、KRAS阻害剤などの標的治療薬の評価を行うことができます。

疾患に関連した変異を再現する能力が向上したことで、基礎となる疾患メカニズムを調べることができます。「私達のKRAS変異細胞モデルによって、研究者達は、発がん性KRASがどのようにMAPKやPI3K経路の異常シグナル伝達を促進し、制御不能な増殖やアポトーシスに対する抵抗性をもたらすかを解明することが可能になりました。「これらのモデルは、薬剤スクリーニング、特に新たに出現したKRAS阻害剤の有効性を試験するためにも極めて重要です。編集細胞株は、KRAS変異がんが使用するシグナル伝達成分を同定するためにも使用されます。これらのシグナルをノックアウトしたり不活性化したりすることで、がんがより脆弱になり、がん治療の効果が高まる可能性があります。

スフェロイドとオルガノイドにおけるCRISPR

疾患モデルは、in vivo環境を忠実に再現することで、より強力なものになります。スフェロイドやオルガノイドなどの3D培養システムの最近の進展により、CRISPR標的の新たな可能性が広がっています。モレル氏は次のように述べています「主な利点のひとつは、患者由来または幹細胞由来のオルガノイドに疾患特異的な変異を直接導入できる点です。これにより、従来の2D培養では失われがちな細胞の多様性や微小環境のシグナルを保持することができます。 たとえば、CFTR変異を導入したCRISPR編集済み腸オルガノイドは、嚢胞性線維症研究において極めて重要な役割を果たしており、生理学的に関連性の高いシステム内で、低分子補正薬や調節薬の評価が可能となっています」。

Kreipke氏によれば、精密なCRISPR遺伝子編集と3D細胞培養の組み合わせは、疾患モデル研究に多方面で革新をもたらす可能性があります。 「より正確な疾患モデルの構築や、より複雑な疾患メカニズムの解明などがその一例です」と述べています。生物学的に妥当性の高い疾患モデルが利用可能になることで、高額な創薬失敗のリスクが減少し（結果として市場に出る医薬品のコストも低下）、創薬開発のタイムラインも短縮されるとクライプケ氏は指摘しています。これらの進展は、スフェロイドやオルガノイドに対するCRISPR遺伝子編集によって実現されるとしています。「患者由来細胞における疾患原因変異をCRISPRで修復することで、遺伝的に一致した健常および疾患オルガノイドを作製でき、実験のばらつきを抑えることが可能になります」と述べています。

肝疾患モデルにおけるCRISPR

DefiniGENは、CRISPRと人工多能性幹細胞（iPSC）を用いて単発性肝疾患を研究しています。DefiniGENは、iPS細胞にCRISPRベースの変異を導入した後、肝疾患の表現型に関連したモデルを形成する肝細胞に分化させます。その後、変異を調べることで、発症メカニズムの調査、治療標的の同定、薬剤候補のスクリーニングが可能になります。

たとえば、DefiniGEN社はCRISPR技術を活用して、α1-アンチトリプシン（A1AT）欠損症の疾患モデルを開発しました。この遺伝性疾患は、肺や肝臓を保護するプロテアーゼ阻害因子であるA1ATの産生異常によって引き起こされます。A1ATの変異により、タンパク質が誤って折りたたまれ、小胞体内に蓄積されます。DefiniGEN社の研究開発責任者であるNikolaos Nikolaou氏は次のように述べています「iPSC由来肝細胞とCRISPR/Cas9技術の可能性を組み合わせることで、疾患細胞内に誤折りたたみされたA1ATが蓄積するという疾患表現型をin vitroで再現する細胞プラットフォームを開発しました」。さらに、DefiniGEN社はこの細胞モデルを、凍結保存された肝細胞として、または自社サービスとして提供しており、A1AT欠損症に対する新規治療薬（低分子化合物やRNAベースの送達システムなど）の大規模スクリーニングに活用可能です。

DefiniGENのシステムのもう一つの強力な特徴は、一つの遺伝的変化が異なる同系細胞ペアを作製し、それぞれに由来する疾患モデルを比較できることです。例えば、健康なiPS細胞から作製された肝臓モデルと、肝臓疾患の原因となる対立遺伝子を封じ込めた肝臓モデルを比較することができます。「これにより、病的変異によって引き起こされる分子的・細胞的表現型の大規模な特徴付けが可能になり、また、高度に制御された方法で複数のiPSC株を用いることができるため、集団の多様性の追跡にも役立ちます。「これは、創薬パイプラインの初期段階において、遺伝的多様性が薬効にどのような影響を及ぼすかについての貴重な情報を提供するので、医薬品開発において特に重要です。 有望ではありますが、CRISPR技術をオルガノイド疾患モデルに応用することは、研究者が克服すべき技術的困難をもたらす可能性があります。例えば、3Dシステムにゲノム編集ツールを導入するのは2D培養に比べて難しく、3Dオルガノイドの複雑さはモデルの再現性を複雑にします。しかし、この組み合わせは依然として有望です。幹細胞由来オルガノイドのさらなる発展により、CRISPRを用いた遺伝子編集との組み合わせは、将来の複雑な疾患モデリングのための鋭く強力な装置となることでしょう」。

この記事はBiocompareに掲載されたものを 許可を得て転載したものです。