マイクロプレートリーダーにおける可変帯域幅の必要性の評価

波長セレクタ（フィルタまたはモノクロメータ）の帯域幅は、研究者がマイクロプレートリーダーを購入する際の重要な検討事項です。マイクロプレートが検出するモノクロメーターの波長範囲として記述される帯域幅は、アッセイの感度と直線性に大きく影響します。具体的には、スペクトル帯域幅（光がピークの最大値の半分にあるときの帯域幅）は、フィルタを通過できる光の量を決定します。帯域幅が狭いと高分解能となり、最大波長が非常に近い蛍光色素間のシグナルを特定して区別することができます。また、帯域幅が広いと、より多くの光がサンプルを励起して検出器に到達するため、シグナル対ノイズ比が向上します。これは、サンプル量が限られ、シグナルが弱い実験に有効です。

可変帯域幅が好まれる理由

基本的に、研究者は精度と感度のバランスがとれたマイクロプレートリーダーを使用しなければなりません。固定帯域幅モノクロメーターを特徴とするマイクロプレートリーダーもありますが、インストゥルメンテーションの設定を微調整できる多様性を研究者に提供する可変帯域幅オプションを提供するマイクロプレートリーダーもあります。この技術により、ユーザーはアッセイの高分解能と高感度の両方を達成するために帯域幅を調整することができます。これは、研究開発ワークフローに柔軟性を必要とする研究者にとって特に有益です。例えば、可変帯域幅によりマルチプレックスが可能になるため、研究者は同じ溶液中でマルチピーク色素や複数の蛍光色素を同時に検出することができます。また、ピーク幅の狭い蛍光色素やストックシフトの小さい蛍光色素を検出する場合にも、最適な感度を実現し、実験のシグナル対ノイズ比を向上させるという明確な利点があります。このような理由から、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）、時間分解蛍光 TRF / TR-FRET（HTRF）、生体発光共鳴エネルギー転移（BRET）などの特異性アプリケーションでは、可変帯域幅へのシフトがかなり進んでいます。

可変帯域幅モノクロメーターは必携のマイクロプレートリーダー機能のように聞こえるかもしれませんが、それにはかなりの課題が伴うことに注意することが重要です。可変帯域幅に切り替えるユーザーは、正確な波長選択を確実にするために、適切なユーザー入力、調整、キャリブレーションを処理する専門知識が必要です。可変帯域幅を不適切に使用すると、定量出力が大幅に乱れ、特に創薬研究のアッセイの結果と妥当性が損なわれる可能性があります。

可変帯域幅は信号、データ解析、時間を損なう可能性

モノクロメーターの帯域幅と信号の相関関係を十分に理解していない研究者にとって、帯域幅の調整は不正確な測定につながる可能性があります。色鮮やかな花が咲き乱れる野原で、真っ赤な花を想像してみてください。帯域幅を狭くすることは、虫眼鏡で花に焦点を合わせ、他の色からの干渉を最小限に抑えることに似ています。しかし、フォーカスを急に調整すると、野原に咲いている他のすべての花が写り込み、赤い花からの信号が影になってしまいます。同じ理屈で、同じアッセイを実行しながらモノクロメーターのバンド幅を変えると、結果が変わることがあります。この変化を考慮し、ユーザーはモノクロメーターのバンド幅を変更するたびに、インストゥルメンテーションの設定を最適化する必要があります。そうしないと、同じアッセイから、その理由を理解することなく、変動性の高いシグナルが発生し続けることになります。正しいガイドラインと経験がなければ、このような最適化は時間がかかり、困難です。

シグナルの変化とともに、マイクロプレートリーダーデータの下流の変化も生じますが、これはモノクロメーターの帯域幅と使用する特異性に大きく依存します。インストゥルメンテーションの帯域幅を変えると、サンプルや検出器に到達する光の量が変化します。これらは検出限界と直線性に直接影響します。その結果、同一のサンプルであっても検出されるシグナルが異なることがあり、異なるプレート間、さらには同じプレートの異なる読み出し値間で定量データを比較することが困難になります。さらに、低濃度のサンプルを扱う場合、帯域幅をわずかに狭めるだけでも感度と直線性が低下し、不正確なプロットが生成されます。同様に、蛍光アッセイ中に帯域幅を広げると、インストゥルメンテーションが不要な蛍光シグナルを検出し、シグナル対ノイズ比が低下するため、検出限界が上昇する可能性があります。

可変帯域幅の多用途性は、最適化の複雑さの影に隠れています。特に、可変帯域幅を持つモノクロメーターは200以上の励起/発光（Ex/Em）の組み合わせを提供し、理想的なEx/Emのペアを見つけるには時間がかかります。複数の色素を使用する研究者は、色素ごとに最適化する必要があり、同じ色素でも濃度が異なればex/emペアが異なることは言うまでもありません。インストゥルメンテーションを複数のユーザーが使用する場合、元のアッセイ設定が前のユーザーによって変更されていないことを確認する必要もあります。全体として、研究者はインストゥルメンテーションの設定を最適化するためだけに何時間も費やしていることに気づくかもしれません。非現実的な最適化は、最終的には、医薬品開発や評価パイプラインに不可欠な標準化された定量を犠牲にすることになります。

固定帯域幅モノクロメーターマイクロプレートリーダーをフィルターオプションで再考

可変帯域幅モノクロメーターはマイクロプレートリーダーの世界における革命なのでしょうか？アッセイ最適化が日常業務の一部であり、ユーザーが可変帯域幅がデータに与える影響を十分に理解している研究開発ラボで得られる汎用性を軽視しないことが重要です。しかし、可変帯域幅は不適切に使用されると厄介なものになる可能性があり、ほとんどの研究者にとって間違いなく不要であることを考慮することが重要です。とはいえ、ここまで述べてきたようなリスクを最小限に抑えつつ、分解能とシグナル対ノイズ比のバランスを実現するソリューションには、現在どのようなものがあるのでしょうか。

ハイブリッド光学系マイクロプレートリーダーは、日常的な実験に使用する固定モノクロメーター帯域幅と、特定のアプリケーション要件を満たすための特異性帯域幅を持つ専用フィルターのいずれかを選択できるオプションを提供します。これらのシステムは、多くの場合、10～25 nmの固定中帯域幅モノクロメーターでセットアップされており、ほとんどの古典的な蛍光色素でシームレスに実行できます。少量のストックシフト蛍光色素の場合、研究者は励起およびEmission波長をシグナル最大値の85～90％にシフトさせることにより、ダイナミックレンジをカバーすることができます。非常に狭い帯域幅または広い帯域幅を必要とするアッセイでは、専用フィルタを使用することで、妥協することなくアッセイの仕様を満たすことができます。このようなインストゥルメンテーションの設計により、ユーザーは最適化に煩わされることなく、将来に備えることができます。

マイクロプレートリーダーモノクロメーターの可変帯域幅について言えば、「あるべきか、ないべきか」が究極の問題です。そして、その答えはエンドユーザーが決めることです。それぞれのシステムには利点と欠点があります。ラボ独自のニーズを満たし、すべてのユーザーが日々の研究で快適に使用できるマイクロプレートリーダーの設計を選択することが重要です。賢く選択する鍵は、そのインストゥルメンテーションでどのようなアプリケーションを実行するか、そしてその研究がどの程度の汎用性を持つかを知ることです。

著者について

キャロライン・カルドネル

モレキュラーデバイスのアプリケーションサイエンティストスーパーバイザーであるキャロラインは、医薬品化学と薬理学の博士号を持ち、17年以上にわたって当社のインストゥルメンテーションとソフトウェアの実務経験を積んできました。モレキュラーデバイスに入社する前、キャロラインは英国のレディング大学で博士課程を修了し、32種類のスラミン類似体を合成し、ドーパミン-D2s受容体-Gタンパク質複合体の形成に対する効果を研究しました。

この記事は Biocompareに掲載されたものを 許可を得て転載したものです。