Application Note EMax Plusマイクロプレートリーダーによるタンパク質定量
- 幅広い用途をカバーする8種類のフィルターを標準装備
- コンパクトな設置面積
- ウォークアップ操作性
- SoftMax Proソフトウェアによる事前定義プロトコル
PDF版（英語）
はじめに
吸光度が多くのアプリケーションで検出法として選択されるようになって以来、エンドポイントリーダーは研究室で多用されている。例えば、サイトカインを定量するためのELISAや、ブラッドフォードアッセイを用いたタンパク質濃度測定などが挙げられます。このアプリケーションノートでは、ブラッドフォードタンパク質定量アッセイを用いて、Molecular Devices EMax® PlusマイクロプレートリーダーとVMaxリーダーの性能を比較します。さらに、EMax PlusマイクロプレートリーダーとEMax Endpointリーダーの性能比較を、マウス/ラットIL-22の定量用サンドイッチELISAを用いて行っています。
ブラッドフォード法
ブラッドフォードタンパク質濃度測定法は、タンパク質溶液への酸性染料の添加に基づく吸光度測定法である1。クマシーブルー色素の吸光度の最大値は、タンパク質に結合すると460 nmから595 nmにシフトする2。未知のサンプルを標準曲線と比較することで、タンパク質濃度の相対測定が可能になる。
Bio-Rad ブラッドフォード タンパク質アッセイキットを定量に使用した。アッセイの感度範囲にあるウシ血清アルブミンの標準曲線をトリプリケートで作製し、96ウェルマイクロプレートにピペッティングした。Coomassie Brilliant Blue G-250色素を説明書に従って1:4に希釈し、タンパク質サンプルに添加した。30分間のインキュベーション後、EMax PlusとVMaxリーダーの両方で585 nmの光学濃度を読み取った。SoftMax® Proソフトウェアを用いて、プレーティングブランクを差し引き、標準曲線を作成した（図1）。両装置のデータを比較した結果、両曲線のR2値は0.98であった。曲線 の直線部分はキット文献の曲線と同等であった。
図1：ブラッドフォードプロテインアッセイと吸光度リーダーの比較。Bio-Rad ブラッドフォード タンパク質アッセイキットを用いて、標準曲線中のウシ血清アルブミン濃度を測定した。両方のインストゥルメンテーションによるシグナル比較はほぼ同じであった。アッセイは5希釈にわたって直線性を維持し、R2値は0.98でした。
ELISAアッセイ
インターロイキン22は免疫機能に関与するサイトカインです。サイトカインのInterleukin-10スーパーファミリーおよびインターフェロンファミリー3 に属し、炎症反応および組織修復における重要なメディエーターです。IL-22は、腸、皮膚、NK細胞およびCD4+ Th1細胞を含む多くの細胞に発現している4。EMax Plus と EMax マイクロプレートリーダーの結果を比較するために、R&D Systems 社の定量的マウス/ラット IL-22 サンドイッチ ELISA が使用された。マウス/ラット IL-22 に特異的なポリクローナル抗体を 96 ウェルマイクロプレートにプレコートした。標準品、コントロール、ブランクをウェルにピペッティングし、インキュベートした後、Molecular Devices MultiWash™+ マイクロプレートウォッシャーで洗浄した。マウス/ラットIL-22に特異的な酵素結合ポリクローナル抗体をウェルに添加し、インキュベートした後、さらに洗浄した。基質を添加し、さらに短時間インキュベートした後、停止液を添加した。吸光度を EMax Plus と EMax マイクロプレートリーダーの両方で読み取った。色の濃さは、最初のインキュベーション中に結合したマウスまたはラットのIL-22の量に比例した。SoftMax Proソフトウェアを用いて、図2に示す各標準曲線を算出した。各曲線のR2値も非常に近かった。
図 2： 吸光度リーダーと ELISA アッセイとの比較。R&D Systems 社の Mouse/Rat IL-22 Quantikine ELISA を使用して、吸光度アッセイにおける EMax Plus と EMax エンドポイントリーダーの性能を比較した。IL-22標準曲線を作成し、MultiWash+ Plate Washerをストリップモードで使用してウェルの洗浄を行い、サンドイッチELISAを実施した。両方のリーダーで ELISA プレートを読み取った結果、各標準曲線はほぼ同じであった。
MultiWash+ マイクロプレートウォッシャー
MultiWash+ マイクロプレートウォッシャーは、96ウェルおよび384ウェルの両方のプレートに設定可能な自動洗浄器です。洗浄/リンスボトル4本と廃液ボトル1本が標準装備されており、柔軟な洗浄が可能です。搭載されたタッチパネルは、20種類の洗浄プロトコルを選択でき、各プロトコル内で最大8サイクルの洗浄が可能です。洗浄のバリエーションには、調整可能な速度と量、調整可能な吸引速度と時間、調整可能な浸漬時間が含まれる。クロスワイズ吸引により、各ウェル内の残留量を減らし、効率的な洗浄を実現。溶液を混合するために、3つの振とうモードが利用可能です。設置面積が小さく、真空・圧力フリーで、搭載ポンプによる静かな洗浄が可能。
セットアップとデータ分析のための3ステッププロセス
ステップ1. SoftMax Proアッセイのセットアップ Plate Setup Wizard（プレーティングセットアップウィザード）がアッセイのセットアップ手順を説明します。ソフトウェアは接続されているインストゥルメンテーションを自動的に認識します。そして、指定されたインストゥルメンテーション用にあらかじめ定義された設定を使用してプロトコルを構築します。この場合、EMax Plusマイクロプレートリーダーがデフォルトでした。
ステップ2. プレートレイアウトの設定。プレートコンフィギュレーションツールを使用して、サンプルとコントロールに適切なウェルを選択します。
ステップ3. データ取得と解析。ブラッドフォードアッセイ用の事前定義された設定を使用して、プレートデータからグラフを自動的に計算します。
概要
EMax Plusマイクロプレートリーダーは、エントリーレベルのプラットフォームでロバスト性の高いソリューションを提供します。SoftMax Proソフトウェアの利便性とパワーにより、幅広いアッセイのセットアップと解析が簡単に行えます。タンパク質定量アッセイとELISAアッセイの両方で、エンドツーエンドマイクロプレートリーダーと同等の性能を示しました。
参考文献
- ブラッドフォード (1976) Anal Biochem. 72:248
- Sedmack, J. 他 (1977) Anal Biochem. 79:544
- Pesta, S. et al. 22:929-79
- Liang, S.C. et al. Med. 203:2271
EMax Plus マイクロプレートリーダーについてさらに詳しく >>
PDF版（英語）